- •Содержание
- •1 Аналитический обзор 11
- •2 Методическая часть 29
- •3. Экспериментальная часть 37
- •4 Обсуждение результатов эксперимента 44
- •Условные обозначения
- •Введение
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Регулярные мультимолекулярные структуры
- •1.2 Хроматография
- •1.2.1 Металл-аффинная хроматография – сочетание принципов лигандообменной и аффинной хроматографии
- •1.3 Методы характеризации сорбентов
- •1.3.1 Удельная поверхность
- •1.3.2 Емкость сорбента, влажность
- •1.3.3 Электрокинетический потенциал
- •1.4 Maldi масс-спектрометрия
- •1.5 Идентификация белков – метод pmf
- •1.6 Тандемная масс-спектрометрия (мс-мс) и идентификация пептиов по фрагментным масс-спектрам
- •1.7 Идентификация пост-трансляционных модификаций
- •1.8 Аддукты зомана с сывороточным альбумином
- •2 Методическая часть
- •2.1 Используемые материалы:
- •2.2 Методики получения сорбента и исследования
- •2.2.1 Получение рмм (FeIii) сорбента
- •2.2.2 Определение удельной поверхности сорбента
- •2.2.3 Определение сорбционной емкости сорбента
- •2.2.3.1 Проведение металл-аффинного анализа
- •2.2.3.2 Определение влажности рмм Fe(III) сорбента
- •2.2.3.3 Определение влажности коммерческого сорбента
- •2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •2.2.4.1 Выделение суммарного белка из обезжиренного сухого молока
- •2.2.4.2 Гидролиз суммарного белка молока коровы в присутствии трипсина
- •2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •2.2.5.1 Гидролиз сывороточного альбумина человека в присутствии пепсина
- •2.2.6 Масс-спектрометрический анализ
- •2.2.6.1 Масс-спектрометрический анализ методом maldi-tof и maldi-tof-tof
- •2.2.6.2 Обработка данных масс-спектрометрического анализа
- •3. Экспериментальная часть
- •3.1. Получение рмм Fe(III) сорбента
- •3.2 Определение удельной поверхности
- •3.3 Определение электрокинетического потенциала и размера частиц.
- •3.4 Определение сорбционной емкости сорбента
- •3.4.1Проведение металл-аффинного анализа
- •3.4.2 Определение содержание пептида в проскоке и контрольном образце
- •3.4.3 Определение влажности коммерческого сорбента и рммс Fe(III)
- •3.5 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы
- •3.5.1 Приготовление микроколонки с сорбентом
- •3.5.2 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.5.3 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.6 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека
- •3.6.1 Приготовление металл-аффинной колонки
- •3.6.2 Выбор элюэнта
- •3.6.3 Металл-аффинная хроматография на коммерческом сорбенте
- •3.6.4 Металл-аффинная хроматография на рммс Fe(III)
- •3.7 Масс-спектрометрический анализ
- •3.7.1 Проведение масс-спектрометрического анализа
- •4 Обсуждение результатов эксперимента
- •4.1 Охарактеризация сорбента
- •4.1.1. Получение рмм сорбента, содержащего ионы железа (III) и приготовление хроматографических колонок.
- •4.1.2 Определение удельной поверхности
- •4.1.3 Определение емкости сорбента
- •4.1.4 Микроэлектрофоретические исследования.
- •4.1.4.1 Определение электрокинетического потенциала
- •4.1.4.2 Расчет удельной поверхности рмм сорбента
- •4.2 Исследование возможности специфичного выделения фосфорилированных пептидов из биологического образца методом металл-аффинной хроматографии с использованием рммс(Fe III)
- •4.3 Разработка метода металл-аффинного выделения прямых ковалентных аддуктов зомана с сывороточным альбумином с помощью рмм сорбентов Fe(III) для последующего масс-спектрометрического анализа
- •4.3.1 Поиск и идентификация аддуктов сывороточного альбумина человека с зоманом
- •4.3.2 Выделение фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека с использованием рммс (Fe III)
- •4.3.2 Масс-спектрометрическая идентификация сайтов связывания зомана с альбумином при взаимодействии с белками in vitro
- •Выводы по работе:
- •Список использованных источников.
- •Приложение а Технико-экономическая оценка научно-исследовательской работы Обоснование договорной цены на разработку
- •Расчет затрат на научно-исследовательскую разработку
- •Расчет затрат на сырье, материалы, реактивы, покупные изделия и полуфабрикаты
- •Расчет затрат на энергоресурсы
- •Расчет затрат на приборы, оборудование для научно-экспериментальных работ и суммы амортизационных отчислений
- •Расчет затрат на оплату труда с обязательными начислениями
- •Прочие затраты Расчет суммы расходов по использованию вычислительной техники.
- •Затраты на выполнение специальных анализов.
- •Расчет суммы накладных расходов
- •Расчет сметы затрат на разработку
- •Приложение б Охрана труда и окружающей среды
- •1 Опасные и вредные производственные факторы
- •2 Пожарная безопасность
- •3 Обеспечение санитарно-гигиенических условий
- •4 Вентиляция
- •5 Аптечка и ее содержание
- •6 Освещение помещения
- •7 Безопасность выполнения работы в лаборатории
- •8 Анализ технологических операций
- •9 Меры первой помощи
- •Охрана окружающей среды
- •Приложение в
- •Приложение г Масс-спектры смеси триптических пептидов казеина, элюированных с колонки с сорбентом, содержащим ионы железа.
2.2.6 Масс-спектрометрический анализ
2.2.6.1 Масс-спектрометрический анализ методом maldi-tof и maldi-tof-tof
Перед нанесением образцов мишени масс-спектрометров тщательно чистили и мыли, не допуская повреждения поверхности мишени. Для удаления механических загрязнений применяли мойку струей воды под давлением. Далее мишени последовательно помещали в чистый ацетонитрил этанол и воду, обрабатывали ультразвуком в течение 20 минут на каждом этапе. После этого мишени ополаскивали этанолом и высушивали на воздухе.
Для создания гидрофобной поверхности на мишень ватным тампоном наносили 10% раствор парафина в хлороформе. После высыхания хлороформа на мишень наносили образцы.
а) Нанесение образца на мишень без предварительного обессоливания
На гидрофобную поверхность наносили 1 мкл раствора матрицы (10 мг/мл СНСА (α-циано-4-гидроксикоричная кислота, Axima Performance) или 5мг/мл DHB (дигидроксибензойная кислота, Varian 902-MS) в 60 %-м ацетонитриле) и 1 мкл пробы и пипетировали для полного смешивания. Затем отбирали 0.6 мкл смеси, наносили на мишень и высушивали при комнатной температуре.
б) Нанесение образца на мишень с предварительным обессоливанием
Обессоливание проб производили на микроколонках, приготовленных из наконечников для микропипеток объемом 300 мкл и сорбента с привитой обращенной фазой С18. После набивки такие колонки промывали небольшими объемами 100 %-го ацетонитрила, затем 0.1 % ТФУ. 5 мкл образца помещали в носик с промытой 0.1% ТФУ мембраной С18 и медленно продавливали шприцем. Проскок собирали в новую микропробирку для контроля в случае неудачного опыта. Затем мембрану с нанесенным на нее образцом тем же путем промывали 10 мкл 0.1% ТФУ, следили за тем, чтобы на стенках носика, особенно до мембраны, не осталось капель жидкости. На последнем этапе в наконечник с мембраной помещали 1.5 мкл раствора CHCA (10 мг/мл) в случае Axima Performance и 0.5 мкл раствора DHB (5мг/мл) для Varian 902-MS Наконечник резко встряхивали для перемещения капли в область мембраны, далее, эту каплю медленно продавливали шприцем сквозь мембрану прямо на мишень. Ждали до полного высыхания
2.2.6.2 Обработка данных масс-спектрометрического анализа
Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра Varian, проводили в программе FTDocViewer (Varian, США).
Обработку спектров, полученных при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF Axima, проводили в программе MALDI-MS Shimadzu Biotech (Shimadzu, Япония). Автоматический поиск сигналов проводили в режиме поиска изотопно разделенных пиков:
ширина пика – 5,
сглаживание по Гауссу, ширина фильтра - 8,
уровень шума – 10-400 мВ (в зависимости от интенсивности спектра),
количество необходимых для определения изотопных сигналов.
Точная моноизотопная масса и форма изотопного распределения для пептидов с нестандартными модификациями рассчитывались при помощи программы MassPro (ИАП РАН).
Поиск в базе SwisProt осуществляли с помощью двух программных комплексов: MASCOT (Matrix Science, Великобритания) и MS-Fit (University of California, San Francisco, prospector.ucsf.edu), при этом использовали следующие параметры поиска: точность определения массы – 50 ppm, возможные модификации – окисление метионина, при необходимости - фиксированная модифицикация остатков цистеина йодацетамидом.
2.2.6.3 MS-MS анализ
Для MS-MS анализа из спектра пептидной смеси выделяли пик нужного пептида с допуском 10 ppm, записывали фрагментный масс-спектр выбранного пептида. Автоматический поиск сигналов проводили в режиме поиска усредненных пиков:
ширина пика – 50,
сглаживание по Гауссу, ширина фильтра - 50,
уровень шума – 0,001 – 0,1 мВ (в зависимости от интенсивности спектра),
ширина фильтра базовой линии – 800.
Идентификацию белков проводили в программе MS-Tag (University of California, San Francisco, prospector.ucsf.edu), при этом использовали следующие параметры поиска: точность определения массы родительского иона – 200 ppm, точность определения массы фрагментов 1000 ppm, возможные модификации – обработка йодацетамидом, в случае поиска аддуктов зомана – изменение массы на 162 Да; а также соответствующая пробе таксономика (человек). Также, при обработке вручную велся поиск сигналов, имеющих разницу масс, соответствующую фрагментации остатка зомана (-162 и -78 Да от родительского иона).