2.2.3.3 Определение влажности коммерческого сорбента

В предварительно взвешенную спиновую колонку поместили 100мкл сорбента (PHOS-Select Iron Affinity Gel, Sigma) и взвесили колонку с сорбентом. Затем с помощью центрифуги (15 сек, 5000 об/мин) отделили жидкость и колонку взвесили вновь. По разности масс установили массу сорбента.

2.2.4 Анализ фосфорилированных пептидов казеина молока коровы

2.2.4.1 Выделение суммарного белка из обезжиренного сухого молока

Навеску 3.5 мг сухого молока растворяли в 1 мл воды до гомогенного состояния (эмульсии) и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 1.5 минут для отделения нерастворимых примесей. Затем отбирали супернатант (4 аликвоты по 100 мкл). Белки осаждали ацетонитрилом (2 раза по 200 мкл: сначала добавляли 200 мкл и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут, затем взбалтывали, добавляли еще 200 мкл и повторяли процедуру). Осажденный белок промывали 50 мкл ацетонитрила и высушивали.

Содержание белков в обезжиренном молоке составляет ~36 % по массе [28]. Известно, что казеин – мажорный компонент смеси белков молока, поэтому расчет необходимого количества трипсина производили исходя из количества казеина.

2.2.4.2 Гидролиз суммарного белка молока коровы в присутствии трипсина

К раствору белка в микропробирке добавили 50 мкл 0.1 М аммонийбикарбонатного буфера (NH₄HCO₃), 50 мкл 10 мМ раствора ДТТ (дитиотриэтол, Sigma Aldrich cat.num. D9779-5G) в 0.1 М аммонийбикарбонатном буфере и инкубировали в течение 45 минут при температуре 56°С с последующим охлаждением до комнатной температуры. Затем, добавляли 50 мкл 20 мМ раствора йодацетамида (Sigma Aldrich №. I6125-5G), выдерживали 40 мин при комнатной температуре в темноте. После этого добавляли трипсин (0.1 мг/мл), помещали емкость со смесью в термостат на 3 часа при 37°С, после чего добавляли столько же трипсина и оставляли еще на 3 часа при 37°С. Количество добавляемого трипсина рассчитывали по мольному отношению белок/фермент 50:1. (Без модификации йодацетомидом: К раствору белка в микропробирке добавили 50 мкл 0.1 М аммонийбикарбонатного буфера (NH₄HCO₃), трипсин (Sigma Aldrich cat.num. T6567-20G, 0.1 мг/мл) и оставили в термостате на 3 часа при 37^°С, после чего добавляли столько же трипсина и оставляли еще на 3 часа при 37^°С. Количество добавляемого трипсина рассчитывали по мольному отношению белок/фермент 50:1)

2.2.5 Анализ фосфонилированных пептидов сывороточного альбумина человека

2.2.5.1 Гидролиз сывороточного альбумина человека в присутствии пепсина

К 500 мкл раствора белка 1 мг/мл добавили 50 мкл 0,1M DTT, инкубировали при 56°С в течение 45 минут. После охлаждения добавили 10 мкл 1 М раствора йодацетамида до его конечной концентрации 20 мМ (Sigma Aldrich № I6125-5G), выдерживали 40 мин при комнатной температуре в темноте. Далее к 400 мкл раствора белка добавляли 100 мкл раствора 0,3 N соляной кислоты. Раствор пепсина (≈1 мг/мл) был приготовлен в 0, 01 N соляной кислоте. Пепсин добавили к раствору белка из соотношения 1:20 по молям (из расчета средней молекулярной массы осажденных белков плазмы крови – 70 кДа). Далее инкубировали образец при 37°С в течение 3 часов, с последующим добавлением еще одной порции пепсина, и оставляли еще на 3 часа при 37^°С. (Без модификации йодацетомидом: К 400 мкл раствора белка добавляли 100 мкл раствора 0,3 N соляной кислоты. Раствор пепсина (≈1 мг/мл) был приготовлен в 0,01 N соляной кислоте. Пепсин добавляли к раствору белка из соотношения 1:20 по молям (из расчета средней молекулярной массы осажденных белков плазмы крови – 70 кДа). Далее термостатировали образец при 37°С в течение 3 часов, с последующим добавлением еще одной порции пепсина.)