Эволюционное значение (преимущество) сплайсинга

Сплайсинг молекул пре-иРНК является древним процессом: сплайсинг протекает у эукариот, у Archaea, у бактериофагов кишечной палочки Escherichia coli, однако он не обнаружен у эубактерий Eubacteria. Идентичное расположение интронов в генах фермента триозофосфатизомеразы клеток человека и злаковых предполагает, что такая прерывистость генов возникла еще до эволюционного расхождения растений и животных, т.е. 800 млн. лет назад (по другим оценкам расхождение растений и животных произошло около 1,2 млрд. лет назад). Одни исследователи, изучающие процессы эволюции, полагают, что предковый организм, от которого произошли ныне живущие прокариоты и эукариоты, использовал интроны, которые были впоследствии утрачены в ходе эволюции нынешними эубактериями. Другие исследователи считают, что процесс сплайсинга появился в ходе эволюции позже. Весьма вероятно, что сложная, громоздкая машина сплайсинга только что описанная произошла от каталитических молекул РНК или специализированных РНК-энзимов (рибозимов), которые были способны к самосплайсингу (см. далее раздел «интроны II группы). Гораздо бóльшая структурная сложность сплайсисомы могла возникнуть для разработки механизма, который делает этот процесс применимым к сплайсингу широкого разнообразия транскриптов РНК, без необходимости кодировать каждым интроном собственный полный рибозим.

Какую же выгоду извлекает клетка из процесса сплайсинга? Сплайсинг безусловно усложняет процесс образования молекул иРНК. Однако, сплайсинг может служить интересам эволюции, благоприятствуя созданию новых генов с новыми функциями через процесс перетасовки экзонов. Поскольку геномы часто подвергаются рекомбинации, гены с новыми функциями могли бы наиболее удобным способом создаваться (возникать) из сегментов существующих функциональных единиц (экзонов) и огромных фланкирующих их интронов путем рекомбинации практически в любом месте интрона. В некоторых случаях, таких как гены иммуноглобулинов и ген пируваткиназы, экзоны кодируют аминокислотные последовательности, которые складываются в независимые структурные домены белков. Таким образом, на пути эволюции, присутствие крупных интронов могло облегчать рекомбинацию с целью создания новых генов кодирующих белки с новыми специфичностями.

Альтернативный сплайсинг и транс-сплайсинг

Сплайсинг также предоставляет клетке возможность «подгонять» структуру генных продуктов к своим соответствующим разнообразным специальным потребностям. Это может быть легко выполнено посредством альтернативного сплайсинга (рис. Pict4 А в папке Сплайсинг), при котором использование разных донорных и/или акцепторных сайтов сплайсинга предусматривает образование из одного гена множества молекул мРНК с частично перекрывающимися последовательностями, каждая из которых кодирует индивидуальный полипептид. Разные (многие) альтернативные 5^/-сайты сплайсинга могут соединяться с общим 3^/-сайтом сплайсинга и наоборот многие альтернативные 3^/-сайты сплайсинга могут соединяться с общим 5^/-сайтом сплайсинга. Таким способом могут добавляться или удаляться части экзонов и целые экзоны. Таким образом, экзон одной мРНК может оказаться в интроне мРНК подвергшейся альтернативному сплайсингу. Не смотря на то, что это явление было впервые обнаружено у вирусов, альтернативный сплайсинг характерен также для клеточных транскриптов, особенно для высших эукариот. В частности в клетках человека примерно одна из четырех пре-мРНК подвергается альтернативному сплайсингу.

Хотя некоторые транскрипты подвергаются альтернативному сплайсингу в клетках всех типов, другие по-разному сплайсируются в отдельных клетках позволяя тем самым продуцировать специализированные формы отдельных белков. Альтернативный сплайсинг общих первичных транскриптов продуцирует ткане-специфичные мРНК для тропонина Т, тропомиозина, сальцитонина и многих нейропептидов мозга. Более того, альтернативный сплайсинг может привести к образованию ткане-специфичных мРНК способных кодировать транскрипционные факторы, которые будут влиять на дифференцированную экспрессию других генов. Полагают также, что альтернативный сплайсинг определяет пол плодовой мушки Drosophila.

Возникает вопрос: как выбираются альтернативные сайты сплайсинга? Было замечено, что фланкирующие области большинства альтернативно сплайсируемых экзонов плохо спариваются с каноническими последовательностями (характерными для классического) согласованного сплайсинга. Это означает, что вариации в множестве факторов лимитирующих сплайсинг могут определять будет ли такой плохо определяемый экзон включен или исключен из зрелой мРНК. Например, когда фактор альтернативного сплайсинга (ASF) был впервые очищен, оказалось, что он является известным фактором сплайсинга (SF2), который как было ранее показано, играет общую роль в сплайсинге. Другой пример, у Drosophila каскад генов (называемых sex lethal, transformer, transformer 2 и double sex) транскрибируется в равной степени, но процесс сплайсинга происходит по-разному у самцов и самок. Высокое отношение Х-хромосом к аутосомам инициирует этот каскад сплайсинга. С этого момента каждый кодируемый белок усиливает или репрессирует сплайсинг последующего генного транскрипта специфичным для самок способом. При соответствующем сплайсинге мушка становится самкой, в противном случае изменение сплайсинга приводит к появлению самцов.

Все известные реакции сплайсинга ядерных транскриптов у высших эукариот происходят интрамолекулярно (т.е. в пределах одного единственного транскрипта). В противоположность этому у некоторых низших эукариот, особенно у трипаносом, происходит межмолекулярный сплайсинг между экзонами двух разных транскриптов. Этот, так называемый транс-сплайсинг, соединяет общую лидерную РНК сплайсинга (spliced leader RNA – SL-RNA, которая соответствует 5^/-экзону) из одного первичного транскрипта с различными кодирующими экзонами из других пре-мРНК (рис. ). Механизм этой реакции похож на обычный механизм сплайсинга пре-мРНК за исключением того, что SL-RNA по-видимому действует и как донор экзона и одновременно вместо U1 РНК. Нематода Caenorhabditis elegans использует как транс-, так и цис-сплайсинг и даже при этом используется несколько видов SL-RNA.

Транспорт и деградация мРНК

Скорость синтеза любого данного белка в значительной степени зависит от цитоплазматической концентрации его мРНК, которая (концентрация) определяется балансом скоростей ее образования и деградации. После завершения процессинга молекулы мРНК транспортируются через поры в ядерной оболочке в цитоплазму, где они направляют синтез белка до тех пор, пока не подвергнутся деградации. Компоненты сплайсисомы связанные с интронами могут препятствовать транспорту мРНК прежде, чем не завершится процесс сплайсинга. Находясь в ядре многие, но не все белки hnRNР-комплексов отделяются от мРНК.

Исследования дрожжевых матричных РНК, которые обычно являются более короткоживущими, чем матричные РНК млекопитающих, позволили проникнуть в суть механизмов деградации мРНК. Первоначально молекулы мРНК довольно устойчивы к деградации, но со временем их 3^/-поли-А хвосты (участки) укорачиваются. Как только поли-А участок уменьшается примерно до 10 нуклеотидов (вероятно, такой участок слишком мал, чтобы связывать защитный поли-А-связующий белок) 5^/-конец мРНК быстро подвергается декэпированию (еще один пример, демонстрирующий тесные взаимоотношения между 3^/- и 5^/-областями матричных РНК). Вслед за декэпированием молекулы РНК быстро разрушаются с двух концов под действием экзонуклеаз, включая ферменты, которые расщепляют мРНК с 5^/-конца и экзосому, разрушающую РНК с 3^/-конца. Скорость уменьшения длины 3^/-поли-А участков варьирует у разных мРНК, определяя тем самым относительное время их полужизни и, следовательно, их стационарную концентрацию.

Хотя описанный выше путь кругооборота мРНК является основным у дрожжей и, вероятно, у высших организмов, он не является единственным. Некоторые молекулы РНК утрачивают кэпы без предварительного удаления 3^/-поли-А участков, другие деградируют в отсутствие декэпирования, кроме того отдельные молекулы РНК могут разрушаться начиная с расщепления по внутренним сайтам. В действительности большинство долгоживущих РНК (рРНК, 5S-РНК и тРНК) никогда не кэпируются и не полиаденилируются. Вероятно, они защищены от деградации прочными вторичными структурами и связью со специфическими белками (см. раздел, посвященный процессингу малых ядрышковых РНК – snoRNA).

Не смотря на то, что процессам кругооборота мРНК вплоть до настоящего времени уделялось меньше «экспериментального внимания», чем механизмам их образования, вероятно, они важны в определении количества белка в результате функционирования гена. Диапазон времени полужизни мРНК позвоночных составляет от нескольких минут (c-fos интермедиат мРНК раннего гена) до нескольких часов (большинство мРНК) и даже до нескольких дней (глобиновая мРНК в ретикулоцитах и мРНК овальбумина в клетках яйцеводов цыпленка). Некоторые механизмы точно определяют этот широкий диапазон скоростей деградации. Многие мРНК с очень коротким временем полужизни такие, как мРНК, кодирующие ряд факторов роста, цитокины и лимфокины, содержат серию AU-богатых элементов, расположенных в пределах их 3^/-нетранслируемых участков. Эти элементы связывают специфические белки, которые делают такие мРНК мишенью для деградации под действием экзосомы (см. выше).

Время полужизни некоторых мРНК может регулироваться в ответ на различные потребности клетки. Например, связывание гормона пролактина с рецепторами на поверхности клеток молочной железы увеличивает время полужизни мРНК, кодирующей казеин молока, от 1 до 40 час, что стимулирует процесс образования молока. Другой пример, внутриклеточная концентрация железа регулирует время полужизни мРНК, кодирующей рецептор трансферрина млекопитающих (необходимый для поступления железа в клетки). Высокая концентрация железа в цитоплазме вызывает отделение защитного белка (железо-зависимого элемента связующего белка) от мРНК, делая ее доступной для расщепления и деградации.

Матричные РНК, включающие стоп-кодоны, появляющиеся в кодирующей области, специфически разрушаются посредством более общего механизма, известного как распад опосредованный нонсенс-кодонами (nonsense-mediated decay). Полагают, что этот механизм защищает клетку от потенциального повреждающего действия «искалеченных» белков, которые могли бы появиться в результате трансляции мРНК включающих стоп-кодоны в середине рамки считывания. Это явление уже давно является загадкой, поскольку такое селективное разрушение предполагается для сплайсированной мРНК в ядрах, а заодно и в цитоплазме, и это несмотря на тот факт, что способность читать кодоны в открытой рамке считывания, как полагают, является исключительно свойством цитоплазмы. Недавнее доказательство некоторой способности к трансляции в ядре может помочь объяснению данного явления.

Иной способ деградации РНК, называемый РНК-интерференцией (RNA interference – RNAi), в настоящее время активно изучается. В соответствии с этим процессом, совершенная дуплексная РНК (такая как природная вирусная РНК или дуплексная РНК, намеренно внесенная исследователями в клетку) расщепляется на фрагменты из 21 нуклеотида, которые направляют разрушения тех мРНК, к которым эти фрагменты комплементарны. В некоторых случаях дуплексная РНК может размножаться сама. Используя РНК-интерференцию, исследователи могут специфически снижать внутриклеточную концентрацию отдельных мРНК. В экспериментах на клетках млекопитающих во избежание путаницы вводятся уже готовые дуплексные РНК, состоящие из 21 нуклеотида. РНК-интерференция широко используется для скрининга генома с цель инактивировать все 18000 генов Caenorhabditis elegans.

Другие виды процессинга транскриптов РНК-полимеразы II

Формирование 3^/-концов мРНК гистонов

Несмотря на то, что большая часть эукариотических мРНК «приобретает» 3^/-polyА-хвосты, основные гистоновые белки подвергаются иному виду процессинга 3^/-конца. Последовательность, расположенная в пределах 3^/-нетранслируемой области пре-мРНК гистонов, является элементом с консервативной последовательностью, который спаривается с U7 snRNP (см. рис. ). Это привлекает дополнительные факторы, которые обеспечивают расщепление пре-мРНК с образованием зрелых 3^/-концов мРНК гистонов. Почему только гистоновые мРНК утрачивают 3^/-polyА-хвосты? Вероятно потому, что эти матричные РНК необходимы только в S-фазе клеточного цикла, когда они транскрибируются, транслируются и быстро распадаются. Утрата ими 3^/-polyА-хвостов может облегчить их быструю оборачиваемость, предотвращая тем самым образование гистоновых белков после завершения репликации ДНК. В противоположность этому мРНК минорных форм гистонов, которые синтезируются в течение всего клеточного цикла, имеют нормальные 3^/-polyА-хвосты.

Малые ядерные (snRNAs) и малые ядрышковые (snoRNAs) РНК

РНК-полимераза II транскрибирует также многие мяРНК, включая большинство молекул РНК U-типа. Некоторые из них, подобно молекулам РНК U-типа сплайсисом, локализованы в нуклеоплазме и называются малыми ядерными РНК (snRNAs) , в то время как другие, такие как U3 и U8 РНК (которые включаются в процессинг молекул рРНК) локализованы в ядрышке и называются малыми ядрышковыми РНК (snoRNAs). Термин U RNA первоначально относился к молекулам РНК, обогащенным остатками Ura, но впоследствии стал использоваться для описания любых молекул РНК, которые относительно малы и располагаются (остаются) в нуклеоплазме при созревании.

Первичные транскрипты многочисленных U мяРНК (U1-U5, U7), транскрибируемых РНК-полимеразой II, приобретают характерные 5^/-кэпы. Подобно молекулам пре-мРНК, кэпирование U мяРНК начинается с добавления обращенного остатка гуанинового нуклеотида, который метилируется по N⁷-положению и 2^/-О-метилируется по первому нуклеотиду исходной РНК (см. рис. ). Эти U мяРНК затем временно экспортируются в цитоплазму где кэп приобретает две дополнительные метильные группы по обращенному гуаниновому остатку, формируя 2,2,7-триметил-гуаниновый кэп, в отличие от 7-метил-гуанинового кэпа в молекулах пре-мРНК. Молекулы U мяРНК, которым предстоит стать частью сплайсисомы, связываются с группой белков, называемых Sm-белками и такие РНП-комплексы реимпортируются в ядро. Аутоантитела, которые узнают Sm-белки (эти антитела получают от пациентов с системной красной волчанкой) стали важным инструментом исследования, помогающим охарактеризовать начальные стадии формирования аппарата сплайсинга. Кэп молекул малых ядрышковых РНК (snoRNAs) также подвергается триметилированию, хотя, по всей вероятности, этот процесс протекает в ядрах.

Следует думать, что все функциональные РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой II, сохраняют 5^/-кэпы, которые добавляются к первичным траскриптам. Эта теория была опровергнута с момента открытия большого нового класса молекул РНК, которые транскрибируются РНК-полимеразой II, но локализуются в интронах других генов и затем вырезаются из этих интронов (см. рис. D). Эти небольшие молекулы РНК относятся к ядрышкам и вместе с рядом связанных белков формируют малые ядрышковые РНП-комплексы (snoRNРs – small nucleolar ribonucleoprotein particles). У млекопитающих более 100 различных snoRNAs, кодируемых интронами, используется в процессинге и модификации молекул рРНК. Дрожжи также имеют аналогичный набор малых ядрышковых РНК, некоторые из которых кодируются интронами, тогда как другие транскрибируются с собственных промоторов.

Кодируемые интронами snoRNAs подразделяют на два основных типа – C/D snoRNAs и Н/АСА snoRNAs в соответствии с присутствующими в них консервативными элементами, которые ответственны за связывание определенных белков. Эти белки связываются с данными консервативными элементами в snoRNAs еще в то время, когда snoRNAs в виде предшественников входят в состав интронов и сохраняются в snoRNAs и после того, как первичный интрон подвергается сплайсингу и дебранчингу. Что определяет концы каждой индивидуальной snoRNA в ходе процессинга неизвестно, но кажется вполне вероятным, что эти связанные белки могут блокировать работу нуклеаз, которые, в противном случае, быстро деградировали бы линейные формы интронов, образующиеся после дебранчинга (т.е. после превращения циклической формы интрона в линейную). Интересно, что большинство генов, интроны которых содержат snoRNAs, кодируют белки являющиеся частью рибосом или связаны с ними. Это могло бы отражать соответствующую функциональную взаимосвязь [так или иначе координирующую образование определенного уровня рибосомных компонентов (белки) и работу аппарата, помогающего формировать рибосомы (snoRNA)]. Однако, кажется наиболее вероятным, что поскольку клетки нуждаются в нескольких тысячах копий snoRNAs, последние должны происходить из высоко транскрибируемых генов, таких как те, которые кодируют множество белков необходимых для транскрипции. Таким образом, существование этого нового класса молекул РНК, образующихся посредством ранее не известного механизма, и действующих ранее не известным способом было достаточно неожиданным.