Практическое занятие № 6. Созревание рнк: процессинг и сплайсинг.

I. Процессинг разных видов рнк эукариот

(Pollard T.D., Earnshaw W.C.)

Различные молекулы РНК, которые, как известно, отличаются своей вторичной и, тем более, третичной структурой выполняют в клетке множество разнообразных функций. Например, матричные или информационные РНК (иРНК) направляют биосинтез белка, транспортные РНК (тРНК) переносят соответствующие аминокислоты на растущую полипептидную цепь, а рибосомные РНК (рРНК) формируют в составе рибосом каталитический центр для белкового синтеза. Вдобавок специфические молекулы РНК (некоторые UРНК и РНК I и II групп) удаляют интроны из незрелых первичных транскриптов иРНК, формируют 5^/-концы транспортных РНК (РНК-компонент в составе РНКазы Р), обеспечивают модификацию и расщепление рРНК (большинство UРНК, малых ядерных РНК), а также расщепление других молекул РНК (например, hammerhead РНК). Молекулы РНК могут даже обеспечивать изменения первичной структуры иРНК (например, направляющая РНК у Trypanosoma) и регулировать развитие метаболических путей (как, например, при формировании пола у Drosophila).

Гены, которые кодируют различные виды молекул РНК у эукариот, транскрибируются в ядрах клеток этих организмов с участием РНК-полимераз I, II или III, однако первичные транскрипты фактически никогда не бывают зрелыми, функционально активными молекулами. Вместо этого, эти крупные предшественники РНК (пре-РНК) подвергаются процессингу в ходе различных реакций включающих разрезание, соединение и химическую модификацию, что в конечном итоге приводит к формированию их конечной физиологически активной структуры. Фактически обнаружение существенных различий в размерах предшественников и зрелых РНК явилось первым доказательством существования процессинга РНК у эукариот. При этом было установлено, что реакции посттранскрипционного процессинга одних видов РНК часто направляются или даже катализируются другими видами РНК.

События, лежащие в основе процесса созревания важнейших видов молекул РНК сильно варьируют в соответствии с природой самих РНК. В частности процессинг молекул пре-иРНК включает 5^/-кэпирование, 3^/-полиаденилирование и «внутренний» сплайсинг. Образование зрелых 18S, 5.8S и 28S рРНК рибосом происходит путем их вырезания из общего предшественника с последующим псевдоуридилированием и метилированием индивидуальных молекул рРНК. Транспортные тРНК, которые также происходят из крупных предшественников, подвергаются разрезанию по обоим концам, происходит добавление нуклеотидов по 3^/-концу, протекают многочисленные реакции модификаций азотистых оснований и, часто имеет место сплайсинг. С другой стороны, эукариотические 5S рРНК не нуждаются в процессинге, в крайнем случае, происходит «подравнивание» их 3^/-концов. В противоположность иРНК эукариот у прокариот первичные транскрипты иРНК непосредственно используются в процессе трансляции, в то время как молекулы 5S рРНК прокариот вырезаются из длинных предшественников пре-рРНК. Как у эукариот, так и у прокариот стационарные концентрации зрелых молекул всех видов РНК определяются комбинацией скоростей их синтеза, процессинга и круговорота.

Процессинг транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II

РНК-полимераза II (pol II) ответственна за образование всех иРНК, некоторых малых ядерных РНК (snRNA, мяРНК) и многочисленных малых ядрышковых РНК (snоRNA). Бóльшая часть транскриптов РНК-полимеразы II подвергается похожим изменениям в ходе процессинга пре-иРНК. Однако иРНК большинства гистонов, а также молекулы мяРНК (snRNA) и snоРНК подвергаются различным изменениям в реакциях созревания. Хотя гены и их первичные транскрипты сильно отличаются в размерах – средняя длина зрелых молекул иРНК млекопитающих составляет примерно 2 kb. В противоположность их ядерные предшественники, называемые гетерогенными ядерными РНК (гяРНК, гяРНК), в 2-20 раз длиннее зрелых иРНК. В конечном счете, только около 10% типичных гяРНК поступает в цитоплазму: остальные распадаются в ядре. В ядре гяРНК превращаются в иРНК в результате реакций включающих модификации их 5^/- и 3^/-концов и удаления сегментов из середины молекул. Эти различные события протекают с высокой точностью на образовавшейся гяРНК как только она отделяется от РНК-полимеразы.

5^/-Кэпирование

Поскольку все виды молекул РНК синтезируются в направлении 5^/ → 3^/, исследователи были поражены фактом отсутствия характерных 5^/-концов у эукариотических иРНК. Вместо этого исходная 5^/-трифосфатная часть первичного транскрипта соединяется с остатком GTP необычной 5^/-5^/-трифосфатной связью, при этом 3^/-ОН группа остатка гуанозина, расположенного на 5^/-конце иРНК, остается свободной. После этого «перевернутый» гуаниновый нуклеотид метилируется по положению N⁷ азотистого основания, а затем первый и иногда второй нуклеотиды исходной иРНК метилируются по 2^/-О-положению рибозы. Образовавшаяся в результате структура получила название 5^/-кэпа (5^/-сар).

5^/-кэп формируется на ранних стадиях транскрипции еще тогда, когда синтезирующийся первичный транскрипт состоит всего из 20-30 нуклеотидов, а ферменты, которые обеспечивают кэпирование являются составной частью комплекса РНК-полимеразы II. Кэп в иРНК действует как место «посадки» (место узнавания для специфических ферментов) специфических ферментов и выполняет несколько функций:

• кэп помогает определить 5^/ границу первого интрона (см. далее) для того, чтобы обеспечить правильный сплайсинг;

• кэп принимает участие в транспорте иРНК из ядра в цитоплазму;

• кэп принимает участие в инициации трансляции благодаря связыванию с фактором инициации трансляции eIF-4Е и обеспечивает начало белкового синтеза с инициирующего кодона AUG в иРНК;

• кэп стабилизирует иРНК и делает ее устойчивой к деградации под действием 5^/-экзонуклеаз.

3^/-Полиаденилирование

На противоположном конце зрелой иРНК начиная от 5^/-конца располагается участок, состоящий из 50 – 200 остатков адениловой кислоты. Эта область обозначаемая поли А (poly A) не кодируется геномом, а добавляется в ходе процессинга в ядре клеток. РНК-полимераза II формирует первичный транскрипт, который часто на многие тысячи нуклеотидов превосходит размеры окончательной зрелой иРНК. Как только 3^/-последовательность иРНК транскрибировалась, специфический участок РНК, выполняющий роль сигнала для полиаденилирования, (он включает последовательность AAUAAA у многоклеточных и, иногда, более вырождающуюся A/U-богатую область у дрожжей), направляет огромный мультиферментный комплекс для расщепления пре-иРНК на расстоянии примерно в 25 нуклеотидов далее последовательности AAUAAA (рис. ). Цепочка остатков А (~200 у человека и ~100 у дрожжей) последовательно добавляется к 3^/-концу формирующейся иРНК. Роly A-хвост образует комплекс с роly A-связующими белками в стехиометрии 1 молекула белка на 10 – 20 остатков адениловой кислоты. Пре-иРНК, которые лишены 5^/-кэпа и 3^/-роlyА быстро расщепляются экзонуклеазами.

Полиаденилирование иРНК выполняет ряд важнейших функций, к числу которых относятся следующие:

• полиаденилирование стимулирует терминацию транскрипции, часто далеко за сигнальной роly A-последовательностью;

• полиаденилирование облегчает удаление 3^/-части интрона (см. далее);

• полиаденилирование способствует транспорту иРНК в цитоплазму;

• полиаденилирование иногда генерирует образование двух иРНК из одного и того же первичного транскрипта благодаря выбору альтернативных сайтов для полиаденилирования. Это позволяет регулировать образование родственных белков с различными С-концевыми аминокислотными последовательностями (одним из наиболее ярких примеров является переключение синтеза мембранносвязанной на секретируемую форму иммуноглобулинов в процессе созревания В клеток);

• полиаденилирование защищает иРНК от деградации (см. далее);

• полиаденилирование принимает участие в инициации трансляции эукариотических иРНК. Оно обеспечивает непонятным пока способом начало трансляции 5^/-конца, расположенного очень далеко от 3^/-полиаденилированного конца. Участие 3^/-конца в инициации трансляции предполагает, что оба конца иРНК взаимодействуют или сообщаются друг с другом в процессе инициации трансляции.

Крайне важно, что наличие 3^/-роly А-хвоста в молекулах иРНК позволяет в лабораторных условиях выделять их методом аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованными последовательностями роly-dТ.