Сплайсинг пре-иРнк эукариот

К началу 70-х годов XX столетия накопилась совокупность загадочных наблюдений. Было обнаружено, что цитоплазматические иРНК намного короче своих ядерных двойников – гяРНК, и это несмотря на то, что и те и другие имели 5^/-кэпы и 3^/-роly А-хвосты. Возникал закономерный вопрос, – каким образом гяРНК могли быть укорочены при сохранении характерных структур на обоих концах полимеров. Ответ был получен в 1977 году после обнаружения явления сплайсинга молекул РНК. Большинство иРНК высших эукариот (и многие иРНК низших эукариот также) закодированы в геноме в «прерывистой» форме. Участки последовательностей кодирующих белки, называемые экзонами, разделены вставочными последовательностями, называемыми интронами, которые могут иметь линейные размеры от 75 до более, чем 10.000 нуклеотидов. Таким образом, первичный транскрипт является копией полного гена, включающий интроны и экзоны: интроны затем удаляются в ходе процесса называемого сплайсингом пре-иРНК.

У одноклеточных эукариот (протистов) интроны, в основном, короткие, в редких случаях первичные транскрипты содержат более четырех интронов в гене, при этом многие гены таких низших эукариот вообще не содержат интронов. В противоположность генам одноклеточных эукариот, гены млекопитающих имеют в среднем 8 интронов, но могут содержать и более 50 интронов причем эти интроны часто оказываются очень длинными, особенно по сравнению с малыми размерами внутренних экзонов у млекопитающих. Крайним случаем является ген дистрофина человека, мутации которого вызывают заболевание – мышечную дистрофию. Этот ген имеет размеры более 2 миллионов пар оснований и содержит более 65 (по другим данным около 80) интронов, которые разделяют экзоны составляющие зрелую иРНК дистрофина размером 14.000 нуклеотидов.

Механизм сплайсинга

Последовательности элементов в гяРНК, которые направляют удаление интронов, представляют собой короткие участки на каждом конце интрона. Практически всегда первые два нуклеотида в интроне, называемые донором сплайсинга или 5^/-сайтом сплайсинга представлены GU, а два других нуклеотида в интроне, называемые акцептором сплайсинга или 3^/-сайтом сплайсинга представлены AG (рис. 1). Фланкирующие последовательности экзонов также проявляют определенную степень консервативности. Вдобавок в интроне присутствует ключевой адениновый нуклеотид – А, представляющий собой точку ветвления интрона (рис. 1), который расположен в пределах консервативной последовательности на расстоянии в 30 нуклеотидов левее 3^/-сайта сплайсинга. Следующий раздел описывает последовательность реакций, которые протекают в ходе сплайсинга, а также роль белков и вспомогательных молекул РНК, облегчающих процесс удаления интронов.

Рис. 1

Сигналы сплайсинга. А – Правильному удалению интронов способствует присутствие специфических элементов отличающихся крайне высокой консервативностью – 5/-сайта сплайсинга, точки ветвления и 3/-сайта сплайсинга. Показано, что структура 5/- (GU) и 3/- (AG) сайтов сплайсинга отличается абсолютной консервативностью. Точка ветвления представлена ключевым остатком аденозина (А), играющим центральную роль в сплайсинге. У млекопитающих последовательности нуклеотидов пре-иРНК, окружающие этот остаток аденозина менее консервативны, чем у дрожжей и включают более 10 пиримидиновых нуклеотидов расположенных между точкой ветвления и 3/-сайтом сплайсинга. В – Последовательность событий в процессе сплайсинга пре-иРНК. Показано необычное строение точки ветвления, где все три ОН-группы рибозы ключевого аденозина (5/-, 3/- и 2/-ОН-группы) включены в образование фосфодиэфирных связей, что обеспечивает формирование структуры петли (вставка).

Анализ сплайсинга в бесклеточных экстрактах показал, что этот процесс включает две реакции переэтерификации (трансэтерификации). Термин трансэтерификация относится к явлению атаки эфирной связи [в данном случае речь идет о фосфодиэфирной связи] атомом кислорода активированной гидроксильной группы. Поскольку при этом одна фосфодиэфирная связь расщепляется, в то время как другая образуется, энергия связи в реакции трансэтерификации сохраняется. Другими словами данная реакция не является АТР-зависмой.

В ходе первой реакции трансэтерификации атом кислорода 2^/-ОН-группы рибозы аденинового нуклеотида в точке ветвления интрона осуществляет нуклеофильную атаку 5^/-сайта сплайсинга. Нужно отметить, что в этом случае точка ветвления интрона и 5^/-сайт сплайсинга должны быть физически сближены. Эта реакция высвобождает левый экзон и связывает адениновый нуклеотид с 5^/-концом интрона необычной 2^/-5^/-связью, в то время как обычные 3^/-5^/-связи продолжают связывать этот адениновый нуклеотид с его соседями (рис. 2). В результате этой первой реакции интрон образует внутримолекулярную петлю, называемую лассо.

В ходе второй реакции трансэтерификации атом кислорода 3^/-концевой ОН-группы высвобожденного ранее левого экзона атакует 3^/-сайт сплайсинга (акцептор сплайсинга), что приводит к ковалентному соединению левого и правого экзонов, завершая тем самым выщепление интрона. Выщепленная петля интрона превращается впоследствии в линейную молекулу под действием дебранчинг-фермента и быстро разрушается.

Малые ядерные РНК (snRNA) и сплайсисома

Реакции сплайсинга осуществляются крупным РНК-белковым комплексом, называемым сплайсисомой, который по своим размерам сравним с рибосомой. Ключевыми компонентами сплайсисомы являются пять малых ядерных рибонуклеопротеидных частиц – мяРНП (snRNP – «snurps»). Каждая мяРНП-частица состоит из малой ядерной РНК – мяРНК (snRNA) связанной с 10-20 белками. В реакциях сплайсинга пре-иРНК принимают участие мяРНК, обозначаемые символами U1, U2, U4, U5 и U6. Некоторые из белков мяРНП-частиц входят в состав всех мяРНП-комплексов, как, например, семь Sm-белков, которые распознаются антителами, вырабатывающимися у некоторых больных с аутоиммунным заболеванием – системной красной волчанкой. Другие белки, обнаруживаемые в мяРНП-комплексах проявляют более высокую специфичность и могут быть связаны только с одной единственной мяРНК. В целом сплайсисомы содержат также множество дополнительных белков, включая белки гяРНП-комплексов, которые предназначены для быстрой упаковки молекул гяРНК на стадии их образования, а также, так называемые SR-белки. Последние богаты серином ( S ) и аргинином ( R ) и их функция состоит в объединении мяРНП-комплексов и других факторов сплайсинга в целую сплайсисому используя белок-белковые взаимодействия. Изучение мутантов дрожжей с нарушением процессинга пре-РНК – prp-мутантов – позволило сделать вывод о том, что в сплайсинге в сумме принимают участие, по крайней мере, 100 различных белков. Такое количество разных белков кодируется приблизительно 2% генома дрожжей, что указывает на сложность процесса сплайсинга РНК и его огромное значение для клетки.

Взаимодействия, возникающие между пре-иРНК и молекулами мяРНК, а также между одной мяРНК и другой мяРНК за счет спаривания их оснований в совокупности со стабилизационной функцией белков заставляют 5^/- и 3^/-сайты сплайсинга, а также точку ветвления интрона приобретать соответствующую пространственную структуру, необходимую для процесса сплайсинга (рис. 3). При этом каждая мяРНП-частица выполняет конкретную, согласованную во времени функцию.

Как следует из рис. 3 малая ядерная РНК U1 ответственна за начальное узнавание 5^/-сайта сплайсинга посредством спаривания ее оснований с последовательностью окружающей сайт GU на левом конце интрона. Затем малая ядерная РНК U2 спаривается с областью точки ветвления интрона, заставляя адениновый нуклеотид экспонироваться для последующего взаимодействия 2^/-ОН-группы его рибозильного остатка с 5^/-концом интрона (рис. 3). У дрожжей малая ядерная РНК U2 спаривается с очень консервативной последовательностью UACUAA^*C в то время как у млекопитающих (в пре-иРНК, которых последовательность, окружающая точку ветвления А, менее консервативна – PyNPyPyPuA^*Py) процесс узнавания точки ветвления малой ядерной РНК U2 облегчается фактором U2AF – белком, который связывает кластер из остатков U и С (называемый полипиримидиновым участком) в 3^/-области интрона. Образованный на предыдущей стадии процесса сплайсинга тройной комплекс, который включает пре-иРНК, U1-мяРНК и U2-мяРНК, соединяется затем с другим тройным комплексом, построенным из трех мяРНП-частиц, содержащих малые ядерные РНК U4, U5 и U6. Малая ядерная РНК U5 удерживает концы соседних экзонов в составе пре-иРНК вместе, а U4-мяРНК, роль которой состоит в том, что она действует как шаперон, высвобождается из комплекса с U6-мяРНК, которая впоследствии вытесняет U1, спариваясь с 5^/-концом интрона. Малая ядерная РНК U6 также удерживает U2-мяРНК, обеспечивая тем самым сближение и удерживание рядом аденинового нуклеотида в области точки ветвления интрона и 5^/-конец интрона. Полагают, что малая ядерная РНК U6 играет центральную роль в реакции сплайсинга. Описанные выше взаимодействия все вместе способствуют активации и экспонированию ключевого аденинового нуклеотида в точке ветвления интрона в пре-иРНК и инициируют, тем самым, первую реакцию трансэтерификации. Заметьте динамическую природу различных РНК:РНК-взаимодействий в сплайсисоме по ходу реакции сплайсинга.

Рис. 3

Взаимодействие малых ядерных РНК с пре-иРНК обеспечивает согласованное протекание сплайсинга. Как только завершается синтез пре-иРНК с ее 5/-сайтом сплайсинга и точкой ветвления путем комплементарного взаимодействия связываются мяРНП-частицы включающие мяРНК U1 и U2, соответственно. У млекопитающих связыванию U2 способствует белок U2AF, который взаимодействует с полипиримидиновым участком и 3/-сайтом сплайсинга. U5 мяРНК участвует в сплайсинге в качестве компонента тройного комплекса с молекулами U4 и U6 мяРНК. В этом случае выступающая на двухспиральном стебле петля U5 мяРНК спаривается с двумя нуклеотидами экзона 1 и первыми двумя нуклеотидами экзона 2. Это приводит к сближению двух фосфодиэфирных связей, которые должны быть расщеплены и реорганизованы в ходе сплайсинга. В составе тройного комплекса U5·U4·U6 U4-мяРНК действует в качестве шаперона, спариваясь на большой протяженности с молекулой U6-мяРНК. Это спаривание впоследствии разрушается с тем, чтобы U6-мяРНК получила возможность спариться с U2-мяРНК вблизи активированной точки ветвления А. Поскольку U5-мяРНК и U6-мяРНК формируют описанные выше взаимодействия с пре-иРНК, молекула U1-мяРНК покидает комплекс, обеспечивая доступ U6-мяРНК к 5/-сайту сплайсинга (не показано). В ходе реакции трансэтерификации в 5/-сайте сплайсинга расщепляется фосфодиэфирная связь и в конечном итоге происходит соединение экзона 1 и экзона 2.

Недавно был выявлен похожий на описанный выше набор минорных мя-РНП-частиц. Они участвуют в катализе сплайсинга необычного класса интронов, которые не подчиняются «правилу GU/AG». Эти интроны включают последовательности AU и AC в 5^/- и 3^/-сайтах сплайсинга, соответственно. В таких случаях вместо U1- и U2-мяРНК используются U11- и U12-мяРНК, а вместо малых ядерных РНК U4 и U6 используются специфические мяРНК U4_atac и U6_atac. Что касается U5 мяРНП-частиц, то они входят в состав обоих видов сплайсисом. Во всех остальных отношениях, механизм сплайсинга интронов, подчиняющихся «правилу AU/AC», по-видимому, аналогичен обычному механизму сплайсинга.