3.Амінокислоти

Рослинні корми (крім бобових і конюшини) бідні на незамінні амінокислоти такі як лізин, метіонін, триптофан та ін. Їх класифікують як лімітуючі або критичні і поповненню ними раціонів сільськогосподарських тварин надають особливого значення.

Синтез білка в організмі відбувається лише тоді, коли необхідні амінокислоти надходять в організмs одночасно в достатній кількості і в необхідних співвідношеннях. Тож якщо раціон не збалансований хоч би по одній незамінній амінокислоті, то це (закон мінімуму) обмежує використання всіх інших амінокислот і протеїну в цілому.

Якість кормового білка має менш важливе значення для жуйних тварин з багатокамерним шлунком. У них білок корму в передшлунку (рубці) розпадається до амінокислот, які далі дезамінуються з виділенням NH₃.

Утворений аміак використовується мікроорганізмами – симбіонтами для росту і синтезу незамінних амінокислот і власного мікробного білка. Мікробна маса, потрапляючи в нижні відділи кишково-шлункового тракту, перетравлюється як звичайний корм і служить джерелом амінокислот для організму. У тварин з однокамерним шлунком такої властивості немає.

Дослідження амінокислотного складу різних органів і тканин рослинних і тваринних організмів показали що вільних амінокислот у природі дуже мало. Добувають їх гідролізом білків, хімічним та мікробіологічним синтезом, ферментативними методами.

Гідролізом білків добувають, при потребі, в основному ті амінокислоти, які входять до складу білків у відносно великих кількостях.

Цим способом виділяють:

● гліцин з желатини;

● глутамінову кислоту – з казеїну та клейковини злаків;

● тирозин – з фіброїну шовку;

● цистин і цистеїн – з шерсті;

● гістидин – з білків крові і т.д.

Проте висока собівартість і дефіцитність вихідної сировини а також багатоступенева хімічна обробка, пов’язана з виділенняv амінокислот і їх очисткою, не дають можливості широко використовувати цей спосіб у промисловості. Разом з тим, кислотний гідроліз призводить до руйнування значної частини амінокислот (триптофану, треоніну і серину), а цистеїн окислюється до цистину.

Ферментативний гідроліз може бути неповним і сам фермент може розпадатись з утворенням відповідних кислот.

Застосування різноманітних хімічних методів дало можливість синтезувати майже всі амінокислоти.

Основним недоліком хімічних методів синтезу (за винятком гліцину) є утворення рацемічних форм (оптично неактивна форма – суміш D- та L-амінокислот).

В організмі людини і тварин – використовуються лишеL-амінокислоти. Виняток становить метіонін, вищі організми засвоюють його в D- та L-формах, тому метіонін виробляється у промисловості хімічним способом.

З амінокислот, які випускає промисловість більше всього у світі виробляється глутамінової кислоти, лізину, метіоніну.

80% лізину виробляють мікробіологічним способом, 20% – хімічним синтезом. Глутамінову кислоту синтезують лише за допомогою бактерій у вигляді мононатрієвої солі і використовують як смакову добавку.

Лізин, метіонін і триптофан – критичні амінокислоти в тваринництві. Найбільш рентабельно й економічно вигідно одержувати амінокислоти мікробіологічним способом за участю ферментів.

Секретом більшості виробничих процесів за участю мікроорганізмів (а саме їх застосування в хімічному виробництві) є зміна умов поживного середовища: саме за рахунок цього досягається синтез надлишку бажаного продукту. Необхідного дисбалансу метаболізму можна добитись шляхом зміни таких факторів як концентрація субстрату, рН, концентрація продукту, шляхом встановлення критичного рівня вмісту інших речовин (іонів металів, органічних добавок) в середовищі.

При переведенні біологічних процесів виробництва амінокислот на комерційну основу розроблені нові способи бажаних змін метаболізму у організмів-продуцентів, спрямовані на збільшення виходу проміжних продуктів, утворення яких в інших умовах знаходиться під суворим метаболічним контролем.

Для виробництва амінокислот бактерії почали використовувати з початку 50-х рр. Штами постійно покращували генетичними методами, виділяючи ауксотрофні мутанти і мутанти із зміненими регуляторними властивостями. Щоб забезпечити утворення амінокислот у великих кількостях у будь-якому випадку необхідно змінити систему регуляції обміну (на відміну від харчового виробництва).

Для цього можна або стимулювати вживання субстрату і виділення амінокислот в середовище, або подавити побічні реакції і процеси деградації амінокислот.

Мікробіологічний метод одержання лізину грунтується на використанні ауксотфних мутантів мікроорганізмів роду Micrococccus, Breviibacterium, Corynebacterium та ін.

Поживне середовище – меляса, до якої додають кукурудзяний екстракт або білкові гідролізати, оцтову кислоту. Джерело азоту – солі амонію або сечовина. Важливу роль відіграє концентрація в середовищі факторів росту: біотину, амінокислот метіоніну, гомосерину і треоніну, макро і мікроелементів.

Біосинтез лізину мікроорганізмами починається з аспарагінової кислоти і проходить через діамінопімелінову, кислоту (другий напрям веде до синтезу гомосерину, який подавлюють). При промисловому виробництві лізину методом мікробіологічного синтезу (Corynebacterium glutamicum) інгібірування процесу здійснюється продуктами реакції – лізином і треоніном. Нагромадження їх у клітинах за принципом зворотного зв’язку призводить до зниження активності аспартаткінази (рис. 1), яка каталізує перетворення аспарагінової кислоти в семиальдегід і тим самим інгібірують наступні етапи біосинтезу лізину.

Схема біосинтезу лізину

Аспарагінова кислота

аспартаткіназа

Семиальдегід

аспарагінової кислоти

гомосерин-

дегідрогеназа

Дигідропіколінова Гомосерин

кислота

Лізин Метіонін Треонін

Ізолейцин

Для зняття обумовленої регуляторними механізмами заборони на біосинтез лізину був отриманий ауксотрофний штам, який не має ферменту гомосериндегідрогенази, який каталізує утворення гомосерину, що в результаті інгібірувало одержання треоніну. Для росту мутанта (ауксотрофного штаму) необхідно було екзогенне (дозоване) введення в поживне середовище треоніну. Це не призводило до включення механізму інгібірування аспартаткінази продуктами реакції і достатній біосинтез лізину у цього мутанта здійснюється з максимальною швидкістю.

Щоб заставити продуцент продукувати лізин і треонін одночасно, пошкоджують механізм, що здійснює інгібірування аспартаткінази продуктами реакції. Мутація гена, що кодує синтез аспартаткінази призводить до того, що змінений фермент функціонує але не інгібується лізином, навіть у надлишку.

Вдосконалення мікробіологічного виробництва лізину покладають на біотехнологію рекомбінантних ДНК.

Технологічна схема одержання лізину складається з двох основних стадій: культивування продуцентів амінокислоти і виділення кінцевого продукту. Нині виробляють 2 види лізину: кристалічний лізин і кормовий концентрат лізину (ККЛ).

Спочатку виробництво обох видів відбувається однаково. Мікроорганізми вирощують у ферментаторах за певних умов. Лізин нагромаджується в культуральній рідині. Для одержання чистого (97 – 98%) лізину її пропускають через іонообмінні колони. Адсорбований на іонообмінній смолі лізин вимивають і кристалізують у вигляді монохлоргідрату (собівартість такого продукту висока).

Для ККЛ культуральну рідину випаровують і висушують з наповнювачами (висівками) (20% лізину). Без наповнювачів утворюється дуже гігроскопічна маса.

Триптофан. Продуцентами можуть бути дріжджі Candida utilis, бактерії E. coli, Bac. subtilis та ін.

Триптофан одержують двома шляхами. Перший грунтується на мікробіологічному синтезі амінокислоти за участю мутантів E. coli і A. Acrogones, в яких дефіцит тирозину і фенілаланіну. Основним проміжним продуктом є шикімова кислота з якої потім утворюється хорізмова.

Другий шлях – трансформація попередника амінокислоти – антранілової кислоти за участю ферментних систем мікроорганізмів. Дріжджі Candida utilis, синтезуючи триптофан, звільняють клітини від шкідливої дії антранілової кислоти. Вони перетворюють її спочатку в індол, а після за участю серину і в присутності піридоксальфосфату – у триптофан.

Для одержання очищеного препарату використовують фільтрат культуральної рідини, а для кормових цілей – кормовий концентрат куди входить і мікробна біомаса.

Продуцентами глутамінової кислоти у промисловості являються Corynebacterium glutamicum і Brevibacterium flavum., а в якості субстратів в залежно від кон’юнктури ринку використовувались парафіни нафти (60-ті роки), глюкоза, меляса, гідролізат кромалю і ацетат (у наш час).

Надсинтез кислоти досягається нестачею у продуцентів ферменту -кетогутаратдегідрогенази і блокування біосинтезу біотину.

Для збільшення біосинтезу глутамінової кислоти необхідна дія на бактеріальну мембрану з метою збільшення її проникаючої здатності для виділення кислоти в культуральне середовище.

Для цього в поживне середовище вводять насичені карбонові кислоти, детергенти (ПАР) або пеніцилін (дорого), який пригнічує біосинтез пептидоглікану клітинної стінки і збільшує її проникність для глутамінової кислоти. Проникаючі властивості також зростають при дефіциті біотину, фосфоліпідів (порушується нормальний синтез фосфоліпідів мембрани).

Передбачається використати біотехнологію рекомбінантних ДНК з метою створення мембран регульованого проникнення, щоб обійтись без додавання дорогих добавок.

Шляхом зміни умов середовища процес ферментації в ході якого утворюється L-глутамат може бути переключений на синтез L-глутаміну або L-проліну.

При високій концентрації біотину та іонів амонію складаються сприятливі умови для утворення L-проліну, а при великій концентрації амонію і іонів Zn в слабко кислому середовищі посилюється синтез L-глутаміну.

Виробництво таких амінокислот як L-глутамат, L-валін, D,L-аланін, L-глутамін, L-пролін за участю диких штамів бактерій базується на використанні властивих цим бактеріям особливостей метаболізму, або на стимуляції утворення амінокислот у відповідь на зміну умов навколишнього середовища. Утворювати амінокислоти здатні бактерії багатьох родів, наприклад, Bacillus, Acrobacter, Microbacterium, Escherichia.

Біотехнологія виробництва L-аспарагінової кислоти

Виробництво у промислових масштабах здійснюється з 1973 р. в Японії на основі іммобілізованих клітин. Вихідна речовина для синтезу – фумарат амонію (продукт мікробного синтезу). Каталізатор – аспартаза мікробного походження (Escherichia coli). З її участю в одну стадію за рахунок приєднання аміаку за місцем подвійного зв’язку утворюється L-аспарагінова кислота.

NH₃ + HOOC-HC = CH-COOH HOOC-CH₂-CH-COOH

│

NH₂

фумарова к-та аспарагінова к-та

Виробництво з використанням розчиненої та іммобілізованої аспартази було не рентабельним. Це внутрішньоклітиний фермент і навіть в іммобілізованому стані був малостабільним. Успіху було досягнуто коли в поліакриламідному гелі іммобілізували цілі клітини E. coli. Період напівінактивації при 37 С складав 120 днів (в іммобілізованих ферментів – 30 днів, розчинених – 10).

Для включення E. coli в гель: у 40 л фізіологічного саліну суспензують 10 кг вологої клітинної маси добавляючи 7,5 кг акриламіду, 0,4 кг метиленбісакриламіду, 5 л 5% диметиламінопропіонітрилу і 5 л 2,5% персульфату калію. При 40 С з гелю формують 2–3 міліметрові кубики. Розчин 1 моль/л фумарату амонію + 0,001 моль/л MgCl₂ при 37 С і рН 8,5 пропускають із швидкістю 0,6 об./год. через колону з іммобілізованими клітинами. Вихід аспарагінової кислоти 95% від теоретичного. Вартість на 40% нижча ніж при використані традиційного методу мікробної ферментації інтактними клітинами.

Іммобілізація бактерій в каррагінановому гелі дозволила ще більше підвищити їх продуктивність у 15 разів, а час напівжиття з 120 днів до 2 років.

Одержання L-аспарагінові кислоти – процес біотрансформації органічних сполук з участю іммобілізованих клітин мікроорганізмів.

Фенілаланін – сировина для одержання підсолоджувача аспартаму (солодший від цукру у 200 разів). Спосіб одержання – мутант (дефіцит тирозину і метіоніну) Brevibact. lactofermentum. Але дорогі поживні середовища.