3. 2. Физико-химические свойства белка

3.2.1. Реакции осаждения белков

Для осаждения белков нужно лишить его факторов, удерживающих белок в растворе, используя различные агенты, снижающие заряд или разрушающие гидратную оболочку белковой частицы. Реакции осаждения могут быть обратимыми и необратимыми.

1).Обратимые реакции осаждения не приводят к глубоким изменениям структуры белка, поэтому получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе. Белки при этом сохраняют свои начальные нативные, включая биологические, свойства.

2).Необратимые реакции вызывают глубокие изменения структуры белка, поэтому получаемые осадки не могут быть растворены в первоначальных растворителях, наступает денатурация белка. Денатурацией называют такое изменение белка, при котором он утрачивает свои естественные биологические и физико-химические свойства, становится менее гидрофильным и теряет способность растворяться в воде.

Практическое значение реакций осаждения белков состоит в том, что они дают возможность: 1) изучить свойства белков, 2) освободить жидкость от присутствия белка, 3) установить наличие белка в моче при патологических состояниях, 4) разделить отдельные белковые фракции на альбумины и глобулины.

Работа 17. Осаждение белков при нагревании

Почти все белки денатурируют при нагревании (50-55^оС и выше). Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства, уменьшается его растворимость (уменьшение гидрофильных свойств ведет к нарушению гидратной оболочки). Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке белка, то есть при такой величине рН, при которой коллоидные частицы белка являются наименее устойчивыми. Поэтому для полного осаждения белка при нагревании следует создавать реакцию среды, соответствующую его изоэлектрической точке. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждают в слабокислой среде, белки, обладающие щелочными свойствами, – в слабощелочной. В сильнокислых и сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда) и несут в первом случае положительный, во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания. Поэтому в сильно кислых и сильно щелочных растворах белки обычно не выпадают в осадок при нагревании. Однако в сильно кислых растворах белки могут коагулировать при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли. Степень влияния ионов нейтральных солей на осаждаемость белков зависит от их способности адсорбироваться на частицах белка. Адсорбированные ионы солей (если они противоположны по знаку заряду коллоидной частицы) нейтрализуют заряд частицы. Наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания и белок выпадает в осадок.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Реактивы: 1%-ный раствор CH₃COOH, 10%-ный раствор NaOH, насыщенный раствор NaCl.

Оборудование: пробирки, капельницы, спиртовка.

ХОД РАБОТЫ. В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка (без NaCl). В первой пробирке нейтральный раствор нагревают до кипения. Жидкость мутнеет, поскольку разрушаются водные оболочки вокруг молекул белка и происходит укрупнение его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.Во 2-ой пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты для слабого подкисления. Через некоторое время выпадает хлопьевидный осадок белка. Частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию. В 3-ю пробирку добавляют 5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд , что повышает их устойчивость. В 4-ю пробирку добавляют 2 капли 10%-го раствора NaOH, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается. В 5-ю пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора NaCl и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок белка, так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия.

Оформление работы. Записать в таблицу результаты осаждения белков при кипячении в различных средах и указать в каждом случае причину появления или отсутствия осадка белка.

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА ПРИ КИПЯЧЕНИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕАКЦИЯХ СРЕДЫ

Щелочная среда	Нейтральная среда	Слабокислая среда	Сильнокислая среда	Сильнокислая среда+электролит

Работа 18. Осаждение белка органическими растворителями.

Белки нерастворимы во многих органических растворителях. Однако их осаждение происходит только из нейтральных и слабокислых растворов и особенно полно в присутствии электролитов (ионные соли связываются коллоидными частицами и снимают заряд). Органические растворители дегидратируют частицы белка (разрушают водную оболочку) и этим понижают их устойчивость в растворе. Кратковременное воздействие органических растворителей сохраняет белок в естественном состоянии, продолжительное воздействие приводит к денатурации.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Реактивы: спирт или ацетон, насыщенный раствор NaCl.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. В пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка и 20 капель спирта или ацетона, раствор мутнеет. При добавлении нескольких капель насыщенного раствора NaCl выпадает осадок белка.

Работа 19. Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами

Осаждение белка концентрированными кислотами происходит вследствие дегидратации белковых частиц и нейтрализацией их зарядов, а также рядом других причин (денатурация, образование солей и др.). В избытке серной и соляной кислот, а также при их длительном воздействии выпавший осадок денатурированного белка растворяется, по-видимому, за счет перезарядки белка и частичного гидролиза. В избытке азотной кислоты растворения не происходит.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Реактивы: концентрированные HCl, H₂SO₄, HNO₃.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. В 3 пробирки наливают по 15-20 капель концентрированной соляной, серной и азотной кислот. Затем осторожно, чтобы жидкости не смешивались, наслаивают равный объем белка. На границе двух слоев жидкости появляется осадок белка в виде тонкой пленки. Осторожно встряхивая пробирки, обнаруживают растворение осадка белка в случае осаждения соляной и серной кислотами, в пробирке с азотной кислотой белок не растворяется.

Работа 20. Осаждение белка органическими кислотами

Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами, однако различные органические кислоты неодинаково действуют на белок. Механизм осаждения белков органическими кислотами объясняется дегидратацией белковой молекулы и снятием заряда.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Реактивы: 10%-ный раствор СС1₃СООН, 20%-ный раствор С₆Н₃(ОН)(СООН)SО₃Н.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. В две пробирки наливают по 5 капель раствора белка, затем в одну пробирку добавляют 1-2 капли раствора ТХУ, в другую – столько же раствора сульфосалициловой кислоты. В пробирках образуется осадок.

Работа 21. Осаждение белка солями тяжелых металлов

При действии солей тяжелых металлов на растворы белка происходит денатурация белковой молекулы. Осаждение денатурированного белка обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимых комплексов. Свойства белков связывать тяжелые металлы используют в медицине, белки применяют как противоядие при отравлении солями ртути, свинца, меди и другими металлами. Белок ограничивает всасывание тяжелого металла, образуя с ним нерастворимые комплексы. При осаждении белков некоторыми солями тяжелых металлов избыток этих солей ведет к растворению (пептизации) первоначально образовавшегося осадка, что связано с адсорбцией тяжелого металла на поверхности коллоидных частиц и появлением положительного заряда на молекуле белка. При избытке серебра и ртути пептизации не наблюдается.

Исследуемый материал: раствор яичного белка.

Реактивы: 10%-ный раствор CuSO4, 5%-ный раствор уксуснокислого свинца.

Оборудование: пробирки, капельницы.

ХОД РАБОТЫ. В две пробирки вносят по 5 капель раствора яичного белка и по 1 капле в первую пробирку 7%-го раствора сульфата меди, во вторую - 5%-го раствора уксуснокислого свинца. В пробирках образуется осадок. В первую пробирку добавляют еще 5-10 капель 7%-го раствора сульфата меди, при этом наблюдается растворение осадка.

Оформление работы. Результаты всех опытов вносят в таблицу.

РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИ БЕЛКА.

Название групп осадителей	Употребляемые реактивы	Характер и цвет осадка	Чем обусловлена реакция?
Органические растворители
Концентрированные минеральные кислоты
Органические кислоты
Соли тяжелых металлов