Раздел 5. Обмен нуклеиновых кислот

Структурными единицами нуклеиновых кислот являются азотистые (пуриновые и пиримидиновые) основания, пентоза (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорная кислота. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований осуществляется клетками большинства тканей. Пуриновое кольцо синтезируется из аминокислот глицина, глутамина, аспартата, производных тетрагидрофолата и СО₂. Пиримидиновое кольцо синтезируется из карбамоилфосфата и аспартата. Нуклеотидные коферменты FAD⁺, NAD⁺, NADР⁺, CoA, являющиеся производными адениловой кислоты, синтезируются из ATP и соответствующих витаминов, а именно рибофлавина, никотиновой кислоты и пантотеновой кислоты. Предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотиды образуются путем восстановления рибонуклеозиддифосфатов.

Конечными продуктами распада пуриновых оснований в процессе их обмена в организме являются мочевая кислота, аллантоин, аллантоиновая кислота, мочевина и глиоксалевая кислота., пиримидиновых оснований – карбаминовая кислота и -аланин. Природа конечного азотсодержащего продукта, выводимого из организма, зависит от вида организма.

Работа 55. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот

Для изучения природы и свойств нуклеиновых кислот необходимо выделение их из ткани в нативном, по возможности неизменном состоянии. Обычно этому препятствуют, главным образом, два обстоятельства: во-первых, крупные молекулы нуклеиновых кислот упакованы в структурах и прочно связаны с другими химическими компонентами клетки, в частности с белками; во-вторых, в клетках всегда есть активные нуклеазы, заключенные преимущественно в лизосомах и переходящие в свободное состояние при гомогенизации тканей. Таким образом, при выделении нуклеиновых кислот особое внимание необходимо уделять инактивации нуклеаз, полноте гомогенизации и очистке препарата от сопутствующих примесей (белки, полисахариды, полифосфаты и др.).

Методы количественного определения нуклеиновых кислот, основанные на спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра, отличаются высокой чувствительностью и простотой проведения анализа. Необходимым этапом различных методов спектрофотометрического определения нуклеиновых кислот является их экстракция из биологического материала, сопряженная с гидролизом полинуклеотидов. В связи с этим нужно иметь в виду, что из исследуемого материала предварительно необходимо удалить свободные нуклеотиды.

В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм.

Исследуемый материал: ткани печени, сердца, скелетной мускулатуры крысы.

Реактивы: HClO₄ – 0,2н и 0,5н растворы.

Оборудование: пипетки, центрифужные пробирки, пробки с воздушным холодильником, водяная баня, центрифуга, спектрофотометр, кюветы.

ХОД РАБОТЫ. Измельченные на холоде навески ткани печени, сердца, скелетной мышцы (100-200 мг) помещают в центрифужные пробирки и доливают в каждую по 5-10 мл охлажденного 0,2 н раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием на холоде при 5000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают и осадок повторно отмывают хлорной кислотой. Такая предварительная обработка материала необходима для удаления кислоторастворимых нуклеотидов. После удаления супернатанта к осадку добавляют 5-10 мл 0,5 н раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушным холодильником, нагревают их в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Эта процедура обеспечивает количественную экстракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала и их кислотный гидролиз до растворимых фрагментов. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют. Гидролизаты из одинаковых тканей объединяют и определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против контрольного раствора – 0,5 н раствора хлорной кислоты. При необходимости гидролизаты разводят тем же раствором.

Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле

С _{мкг Фн} = (А₂₇₀ – А ₂₉₀) : 0,19,

где 0,19 – значение А = (А₂₇₀ – А₂₉₀), которое имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора. При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются средним пересчетным коэффициентом 10,3:

С _{мкг НК} = С _{мкг Фн} ^. 10,3.

Рекомендуется проводить дополнительное определение оптической плотности при 260 нм; оптическая плотность при 260 и 270 нм не должна различаться более чем на 15%.