- •Биологическая химия и молекулярная биология Руководство к лабораторным работам
- •Содержание
- •Рабочая программа курса «биохимия и молекулярная биология»
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Часть 1 Раздел 1 Углеводы
- •Открытие углеводов в растворах
- •2. Восстанавливающие свойства углеводов
- •1.3. Полисахариды Работа 6. Кислотный гидролиз крахмала
- •Работа 7. Выделение гликогена из печени
- •Раздел 2. Липиды
- •Работа 8. Определение кислотного числа
- •Работа 9. Определение числа омыления
- •Работа 11. Качественные реакции на обнаружение витамина е
- •Работа 12. Качественные реакции на ацетон и ацетоуксусную кислоту
- •Раздел 3 Белки
- •3.1. Химическая природа белка (цветные реакции)
- •3. 2. Физико-химические свойства белка
- •3.2.1. Реакции осаждения белков
- •3.2.2. Растворимость белков
- •Высаливание белков
- •3.2.4. Определение изоэлектрической точки белков
- •3. 3. Гидролиз белков
- •Качественные реакции на открытие составных частей сложных белков
- •Раздел 4 Нуклеотиды
- •Работа 29. Исследование состава нуклеиновых кислот
- •Раздел 5. Витамины
- •Работа 30. Количественное определение аскорбиновой кислоты
- •Работа 31. Количественное определение витамина р в чае
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 6. Ферменты
- •6.1. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
- •Работа 32. Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность холинэстерзы
- •6.2. Влияние рН на скорость ферментативных реакций
- •Работа 34. Влияние рН на активность амилазы слюны
- •Влияние рН на активность амилазы слюны
- •6.3. Специфичность действия ферментов
- •Работа 35. Специфичность действия α-амилазы слюны
- •Работа 36. Специфичность действия сахаразы
- •6.4. Открытие ферментов различных классов
- •Работа 37. Идентификация оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Буферные растворы
- •Фосфатный буфер (0,1м), рН 5,8-8,0
- •Бикарбонатный буфер (0,1 м), рН 9,2-10,8
- •Трис-буфер (0,05 м), рН 7,2-9,1
- •Раздел 2. Обмен углеводов
- •Работа 43. Количественное определение углеводов
- •Определение содержания глюкозы в сыворотке крови энзиматическим методом
- •Работа 44. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 45. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 46. Определение гликолитической активности эритроцитов
- •Работа 47. Количественное определение содержания гликогена в печени и скелетных мышцах крысы
- •Раздел 3. Биоэнергетика
- •Работа 48. Сравнительное изучение активности сукцинатдегидрогеназы в различных тканях крыс и ее конкурентное торможение
- •Работа 49. Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (атр и креатинфосфата)
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 4. Обмен липидов Работа 50. Исследование действия липазы поджелудочной железы.
- •Работа 51. Определение общих липидов в сыворотке крови
- •Работа 52. Количественное определение липопротеинов низкой плотности (лпнп) в сыворотке крови
- •Работа 53. Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)
- •Работа 54. Определение общих фосфолипидов в плазме крови
- •Раздел 5. Обмен нуклеиновых кислот
- •Работа 55. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
- •Работа 56. Определение температуры «плавления» водородных связей
- •Работа 57. Определение содержания мочевой кислоты
- •Работа 58. Определение активности рибонуклеазы
- •Раздел 6. Обмен белков и аминокислот Работа 59. Количественное определение белка
- •1. Биуретовый метод
- •2. Микробиуретовый метод
- •3. Метод Брэдфорд
- •4. Спектрофотометричекий метод
- •Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 61. Определение активности аргиназы печени
- •Работа 62. Количественное определение креатинина в моче и сыворотке крови
- •Работа 63. Определение активности аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрасферазы
- •Работа 64. Переаминирование аминокислот
- •Работа 65. Оценка биосинтетической функции ткани по соотношению рнк и днк к белку
Работа 63. Определение активности аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрасферазы
Аминотрансферазы или трансаминазы – ферменты, содержащие в качестве коферментов фосфопиридоксаль и фосфопиридоксамин, катализируют обратимый перенос аминогрупп с аминокислот на α-кетокислоты. Определение концентрации α-кетокислот, образовавшихся в процессе трансаминирования аминокислот, лежит в основе методов определения трансаминазной активности. Существует 2 группы методов определения активности трансаминаз в сыворотке крови: спектрофотометрические и колориметрические. В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга, эти методы наиболее специфичные и точные. Колориметрические методы основаны на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования.
Наибольшее значение имеет определение активности двух ферментов - аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), поскольку эти ферменты обладают большой каталитическлой активностью. Эти ферменты находятся в различных тканях и органах: печени, миокарде, почках, скелетной мускулатуре и др. Содержание данных ферментов в тканях неодинаково (в печени намного выше, чем в миокарде).
АсАТ катализирует реакцию:
Аспарагиновая + α-кетоглутаровая → Глутаминовя + Щавелевоуксусная
кислота кислота кислота кислота
АлАТ катализирует реакцию:
α-Аланин + α-кетоглутаровая → Глутаминовая + Пировиноградная
кислота кислота кислота
В результате переаминирования под действием АсАТ аспарагиновая кислота превращается в щавелевоуксусную, а аланин под действием АлАТ – в пировиноградную кислоту. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется динитрофенилгидразон пировиноградной кислоты.
Гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде дает коричнево-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты, а по количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об активности фермента.
Активность аминотрансфераз выражают в микромолях пировиноградной кислоты, образовавшейся 1 мл сыворотки крови за 1 ч инкубации при 37ºС. В норме активность аминотрансфераз в сыворотке крови человека невелика и составляет для АсАТ от 0,1 до 0,45 мкмоль/ч·мл, а для АлАТ – 0,1-0,68 мкмоль/ч·мл пировиноградной кислоты за 1 ч инкубации.
Исследуемый материал: сыворотка крови, печень, почки, миокард, скелетная мускулатура крысы.
Реактивы: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), субстратная смесь для определения АсАТ, субстратная смесь для определения АлАТ, динитрофенилгидразин, стандартный раствор пировиноградной кислоты.
Оборудование: весы, термостат, фарфоровая чашка, пестик, пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной светового пути 5 мм.
ХОД РАБОТЫ. Получение сыворотки крови. Свежую негепаринизированную кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Сыворотку осторожно отсасывают пипеткой и помещают в чистую сухую пробирку.
Приготовление гомогената. Взвешивают 500 мг ткани, тщательно гомогенизирую ее в 2 мл фосфатного буфера, после этого добавляют еще 3 мл и отфильтровывают через 2 слоя марли. Фильтрат используют для определения активности АлАТ и АсАТ.
Определение активности аланинаминотрасферазы (КФ 2.6.1.2.). Готовят инкубационные пробы согласно табл. 1.
Таблица 1
Реагенты (мл) |
Опытная проба |
Контрольная проба |
Субстратная смесь для определения активности АлАТ |
0,25 |
0,25 |
Дистиллированая вода |
- |
0,05 |
Пробы перемешать и выдержать в термостате при 37ºС 1-2 мин |
||
Сыворотка крови |
0,05 |
- |
Пробы перемешать и выдержать при температуре 37ºС в течение 60 мин |
||
Динитрофенилгидразин |
0,25 |
0,25 |
Пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре 20 мин |
||
0,4 М раствор NaOH |
2,5 |
2,50 |
Пробы немедленно перемешать. Выдержать при комнатной температуре 10 мин и измерить оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной пробы при длине волны 505 нм (490-520 нм, зеленый светофильтр).
Активность аланинаминотрансферазы рассчитывают по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика приготовить пробы согласно табл. 2.
Таблица 2
Реагент |
№ проб |
||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Дистиллированная вода (мл) |
0,60 |
0,55 |
0,50 |
0,45 |
0,40 |
Стандартный раствор пировиноградной кислоты (мл) |
- |
0,05 |
0,10 |
0,15 |
0,20 |
Динитрофенлгидразин (мл) |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Все пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре 20 мин |
|||||
0,4 М раствор NaOH (мл) |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
Пробы перемешать, выдержать при комнатной температуре 10 мин и измерить оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной |
|||||
Содержание пирувата, нмоль |
- |
50 |
100 |
150 |
200 |
Активность фермента, мкмоль/(ч л) |
- |
1 |
2 |
3 |
4 |
Активность фермента, нмоль/(c л) |
- |
278 |
556 |
834 |
1112 |
По результатам фотометрирования калибровочных проб построить график зависимости оптической плотности от активности фермента. По оси ординат отложить значение оптической плотности, а по оси абсцисс – активность фермента (см. табл.2). Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат. При активности АлАТ, равной 2-3 мкмоль/(ч л), сыворотку развести в 3 раза, равной 2,5-3 мкмоль/(час · л) – в 5 раз, равной 3,0-3,5 мкмоль/(ч л) – в 10 раз, равной 3,5-4,0 – в 25 раз. Провести повторное определение и учесть коэффициент разведения при расчете.
Определение активности аспартатаминотрансферазы (КФ 26.1.1.). Готовят инкубационные пробы согласно табл.3.
Таблица 3
Реагенты (мл) |
Опытная проба |
Контрольная проба |
Субстратная смесь для определения активности АсАТ |
0,25 |
0,25 |
Дистиллированая вода |
- |
0,05 |
Пробы перемешать и выдержать в термостате при 37ºС 1-2 мин |
||
Сыворотка крови |
0,05 |
- |
Пробы перемешать и выдержать при температуре 37ºС в течение 60 мин |
||
Динитрофенилгидразин |
0,25 |
0,25 |
Пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре 20 мин |
||
0,4 М раствор NaOH |
2,5 |
2,50 |
Пробы немедленно перемешать. Выдержать при комнатной температуре 10 мин и измерить оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной пробы при длине волны 505 нм (490-520 нм, зеленый светофильтр).
Активность АсАТ рассчитывают по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика пробы готовят согласно табл. 2.
Клинико-диагностическое значение. Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет исключительно важное значение для диагностики болезней печени. В начальные периоды инфаркта через 4-6 ч наблюдается повышение активности АсАТ, через 24-36 ч оно четко выражено и лишь на 3-7-й день активность фермента снижается до нормы, изменение же АлАТ при этом небольшое.
Активность обеих трансфераз, особенно АлАТ, увеличивается при инфекционном гепатите. Особенно важное значение для диагностики имеет увеличение активности АлАТ при безжелтушных формах гепатита и в инкубационном периоде. С увеличением сроков заболевания активность аминотрансферазы постепенно снижается. У детей наблюдается более ранняя нормализация. В случае затяжного течения заболевания проявляется длительная гиперферментемия, при рецидивах и обострениях активность аминотрансфераз вновь повышается. При токсическом гепатите и обострении хронического гепатита часто наблюдаются высокие показатели ферментативной активности. Цирроз печени даже в активной фазе не сопровождается значительной гиперферментемией.