Работа 49. Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (атр и креатинфосфата)

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТР и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу большим количеством энергии.

Основной путь образования АТР в тканях – окислительное фосфорилирование в процессе тканевого дыхания. Креатинфосфат образуется в мышце при участии АТР в состоянии покоя и служит резервом высокоэргического фосфата для синтеза АТР из ADP при активной мышечной работе.

Принцип метода. Метод определения макроэргических соединений в мышцах основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТР, богатые энергией, так же как и фосфатный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде (так называемый лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на долю макроэргических соединений мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Исследуемый материал: скелетные мышцы крысы.

Реактивы: 2,5%-ный раствор ТХУ, 1 М раствор НСl, 1 М раствор NaОН, 1%-ный раствор молибдата аммония, 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты.

Оборудование: пробирки, пипетки, воронки, фильтры, мерная пробирка или цилиндр объемом 10 мл, ледяная и кипящая водяная бани, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

ХОД РАБОТЫ. Мышечную кашицу в количестве 0,5 г помещают в пробирку, стоящую на ледяной бане, и добавляют в нее 5 мл охлажденного раствора ТХУ. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой для экстрагирования АТР и креатинфосфата в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в мерную пробирку, стоящую на ледяной бане.

Остаток мышечной кашицы в пробирке заливают 5 мл дистиллированной воды и продолжают экстракцию 5 мин на холоде. Полученный экстракт фильтруют в ту же мерную пробирку и доводят общий объем до 10 мл дистиллированной водой.

В 2 пробирки – контрольную и опытную – наливают по 0,5 мл безбелкового фильтрата. В опытную пробирку добавляют 1 мл 1 моль/л НСl, закрывают фольгой и помещают на кипящую водяную баню на 10 мин для гидролиза фосфорных связей. Затем раствор охлаждают и добавляют 1 мл 1 моль/л NaOH.

В контрольную пробирку (без предварительного кипячения) добавляют 1 мл 1 моль/л раствора НСl и 1 мл 1 моль/л NaOH. Затем в обе пробирки добавляют по 7,5 мл дистиллированной воды до получения объема 10 мл.

Дальнейшие процедуры проводят обязательно одновременно. Из обеих пробирок отливают по 5 мл жидкости, переносят в 2 другие пробирки и добавляют в каждую из них по 0,5 мл молибдата аммония, 0,5 мл аскорбиновой кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Смесь в каждой пробирке быстро перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре точно 10 мин.

Контрольную и опытную пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (длина волны 670 нм) в кюветах с толщиной слоя 1,0 см против воды. В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфат представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и солей фосфата, присутствующих в тканях. В контрольной пробе определяются только фосфатные соли.

Вычитают из оптической плотности, найденной для опытной пробы, оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфата в пробе находят по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют концентрации неорганического фосфата от 200 мкг до 20 мкг в пробе.

Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора в миллиграммах на 100 г сырой массы, учитывая разведение:

х = А (3,3• 400) •100,

где х – содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТР в 100 г сырой ткани, мг/100 г; А – содержание АТР в пробе, мг; 3,3·400 - коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

Принцип метода и полученные результаты записывают в тетрадь.