Детектор

Существует два варианта детектирования в ВЭЖХ: универсальное и селективное.

При универсальном детектировании происходит измерение общей характеристики подвижной фазы, например, показателя преломления или электропроводности. В этом случае детектируемое вещество измеряется косвенно по изменению характеристик подвижной фазы.

При селективном детектировании происходит измерение характеристик самого детектируемого вещества, например, его поглощение ультрафиолетового излучения, флуоресценции или диффузионного тока.

В процессе развития жидкостной хроматографии было испытано более 20 типов различных детекторов, из которых в настоящее время наиболее широко применяются фотометрические, флуоресцентные, рефрактометрические и электрохимические детекторы (табл. 2).

Таблица 2	Сравнительная характеристика некоторых детекторов для газовой хроматографии
Детектор		Измеряемое свойство ПФ	Чувствительность, г	Определяемые Вещества
Фильтровой фотометрический		Оптическая плотность при определенной длине волны, пропускаемой фильтром	10-10	Вещества, поглощающие электромагнитное излучение с длиной волны, пропускаемой фильтром
Спектрофотометрический		Оптическая плотность при выбранной длине волны	10-9	Вещества, поглощающие электромагнитное излучение с выбранной длиной волны
Спектрофотометрический на фотодиодных линейках		Оптическая плотность в диапазоне длин волн 200 – 800 нм	10-9	Вещества, поглощающие электромагнитное излучение в диапазоне длин волн 200 – 800 нм
Рефрактометрический		Разность показателей преломления элюата и элюента	10-6	Универсальный
Флуориметрический		Интенсивность испускаемого света	10-11	Вещества, обладающие флуоресценцией или способные образовывать флуоресцирующие производные
Кондуктометрический		Электропроводность элюата	10-10	Ионы
Амперометрический		Сила тока при постоянном потенциале электродов	10-11 – 10-9	Вещества, способные к электрохимическому окислению или восстановлению при данном значении потенциала рабочего электрода

Рис. 3 Проточная фотометрическая ячейка для фотометрического детектирования в ВЭЖХ

Фотометрические детекторы используются наиболее часто (детектирование с их помощью составляет свыше 70% случаев). Принцип действия фотометрических детекторов основан на применении закона светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера. Для измерения светопоглощения подвижной фазы на выходе из колонки используют проточные фотометрические ячейки Z-образной формы (рис. 3). Луч света проходит через проточную ячейку и частично поглощается раствором с анализируемым веществом, поступающим в проточную ячейку из колонки.

Для уменьшения размывания хроматографических пиков объем ячейки стараются сделать как можно меньше – от 1 до 10 мкл. Длина оптического пути ячейки составляет 2 – 10 мм. При измерениях в УФ области оптические окна кюветы необходимо изготавливать из кварца.

Большинство органических соединений (ароматические и гетероциклические соединения, вещества молекулы которых содержат функциональные группы С=О, С=S, N=O, N=N и сопряженные связи) имеют интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200 – 800 нм, что и определяет широкое распространение фотометрических методов детектирования, в том числе и для анализа лекарственных препаратов.

Фотометрические детекторы подразделяют следующим образом:

• детекторы с фиксированной длиной волны (фотометры);

• детекторы с дискретно изменяемой длиной волны с помощью оптических фильтров (фильтровые фотометры);

• спектрофотометрические детекторы, регистрирующие поглощение в определенной области УФ спектра;

• спектрофотометрические детекторы на фотодиодных матрицах.

Фотометры являются наиболее простым вариантом фотометрических детекторов. Различают фотометры с фиксированной длиной волны и с дискретно изменяемой длиной волны (фильтровые фотометры). Детектирование проводят при фиксированной длине волны (обычно используют длину волны 254 нм, вблизи которой находятся максимумы поглощения всех ароматических и многих других органических веществ).

Более удобными являются спектрофотометрические детекторы с плавно изменяемой длиной волны, которые позволяют регистрировать разделяемые вещества по поглощению света при любых длинах волн УФ и видимого диапазона. Для выделения спектральной полосы в этих детекторах используют дифракционные решетки или интерференционные фильтры с заданной шириной спектральной полосы. Спектрофотометрический детектор позволяет снять спектр анализируемого вещества, но только после остановки потока подвижной фазы, при этом сканирование спектра занимает несколько секунд или даже минут в зависимости от диапазона длин волн.

Наиболее современными в настоящее время являются спектрофотометрические детекторы с фотодиодной матрицей – диодно-матричные детекторы (ДМД). В традиционных фотометрических детекторах полихроматическое излучение сперва попадает на входную щель монохроматора, а затем монохроматор селективно направляет узкие полосы монохроматического излучения на входную щель.

В ДМД полихроматическое излучение сперва подается на проточную ячейку, через которую проходит элюат, а затем световой поток попадает на поверхность монохроматора и делится на монохроматические пучки света, каждый из которых попадает на фотодиодную матрицу, содержащую как правило 316 диодов. При использовании ДМД проба сканируется каждые несколько миллисекунд, т.е. спектральная информация подается практически непрерывно. Информация, полученная с помощью этого детектора, может быть представлена в виде трехмерной диаграммы (рис. 4), что позволяет проверить однородность пика (соответствует ли данный пик одному соединению).

Рис. 4 Трехмерная диаграмма, полученная с помощью ДМД, при определении фенантрена.

При работе с ДМД можно зафиксировать спектр каждого компонента и установить максимальное поглощение в конкретной области длин волн. Кроме того, ДМД позволяют проводить количественный анализ, даже если хроматографические пики разрешены не полностью.

К недостаткам фотометрических детекторов можно отнести невозможность определения оптически неактивных соединений. Также ограничивает их использование непрозрачность некоторых растворителей по отношению к УФ излучению в интересующей аналитика области длин волн.

В основе работы рефрактометрического детектора лежит непрерывная регистрация изменения показателя преломления элюата на выходе из колонки по сравнению с чистым элюентом. В свою очередь, показатель преломления изменяется пропорционально концентрации определяемого вещества. Рефрактометрический детектор является универсальным, и совместим практически с любой подвижной фазой. Он является незаменимым в тех случаях, когда определяемые компоненты не поглощают электромагнитное излучение в УФ и видимой области спектра, не обладают электрохимической активностью и флуоресценцией. Основным недостатком рефрактометрического детектора является низкая чувствительность, которая может быть повышена за счет выбора максимально адекватной подвижной фазы: использованием элюента с очень высоким или очень низким показателем преломления. Кроме того, этот детектор требует термостатирования с точностью до ±0.001°С, не подходит для градиентного элюирования.

Флуориметрический детектор использует способность определяемых соединений к люминесценции под различными воздействиями, из которых чаще всего используют облучение электромагнитным излучением. Для определения многих природных соединений, лекарственных препаратов и других физиологически активных веществ обычно используют собственную флуоресценцию. Для детектирования нефлуоресцирующих веществ следует получить их флуоресцирующие производные. Например, аминокислоты, не обладающие собственной флуоресценцией, превращают в флуоресцирующие производные по реакции с дансилхлоридом (5-N,N'-диметиламино-1-нафталинсульфохлоридом):

Рис. 5 Дериватизация аминокислот с образование флуоресцирующих

производных

Чувствительность флуоресцентного детектора примерно в 100 раз превышает чувствительность фотометрических детекторов. Кроме того, флуориметрический детектор значительно селективнее, чем фотометрический, поскольку далеко не все соединения, поглощающие электромагнитное излучение, способны флуоресцировать.

При работе с флуориметрическим детектором следует учитывать, что примеси, содержащиеся в элюенте, а также растворенный кислород способны вызывать тушение флуоресценции. Такое же действие оказывают кислородсодержащие растворители. Поэтому перед началом работы с флуориметрическим детектором необходимо убедиться в отсутствии фоновой флуоресценции элюента.

Из группы электрохимических детекторов в ВЭЖХ наибольшее распространение получили кондуктометрический и амперометрический детекторы.

Кондуктометрический детектор широко применяется в ионной хроматографии. Детектирование основано на измерении электропроводности элюата, которая пропорциональна концентрации ионов. Для подавления фоновой электропроводности элюента часто используют подавляющую колонку.

Амперометрический детектор подходит для детектирования всех соединений, способных окисляться или восстанавливаться в диапазоне потенциала, установленного на рабочем электроде. В водном растворе этот диапазон составляет от -0.8 до +1.2 В. К рабочему электроду прикладывают постоянный потенциал, и измеряют предельный диффузионный ток при данном потенциале относительно электрода сравнения. Амперометрический детектор очень чувствительный и селективный. Он используется для определения фенолов, гормонов стресса (адреналина и норадреналина), пестицидов и нитрозоаминов.

В настоящее время существуют и другие возможности детектирования в ВЭЖХ – это комбинация ВЭЖХ с масс-спектрометрией для идентификации органических соединений и с атомно-абсорбционной спектрометрией для определения элементов.