Глава

Жидкостная хроматография

1. Общая характеристика

Жидкостная хроматография – группа хроматографических методов, в которых подвижной фазой является жидкость.

Метод жидкостной хроматографии применим для анализа более широкого круга веществ, чем метод газовой хроматографии, поскольку большинство веществ не обладает достаточной летучестью, многие из них не устойчивы при высоких температурах и разлагаются при переводе в газообразное состояние.

В отличие от газовой хроматографии, где подвижная фаза выполняет только транспортную функцию, в жидкостной хроматографии подвижная фаза представляет собой активный элюент, молекулы которого взаимодействуют с молекулами разделяемых веществ и неподвижной фазой. Поэтому селективность разделения в ЖХ определяется не одним, а двумя факторами – природой подвижной и неподвижной фаз.

Существуют различные способы классификации жидкостной хроматографии. В качестве классификационных признаков могут выступать преобладающий механизм разделения, характер неподвижной фазы, полярность фаз и др.

2. Колоночная жидкостная хроматография

В колоночной жидкостной хроматографии сорбент находится в стеклянной или металлической трубке (колонке).

В классическом варианте колоночной хроматографии используются сорбенты с диаметром частиц более 100 мкм. Колонка может иметь длину до нескольких метров. Элюент продвигается по колонке под действием силы тяжести.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используются сорбенты, обладающие особыми свойствами (однородность частиц, ненабухаемость и т. д.). Диаметр частиц этих сорбентов не превышает 30 мкм. Часто в ВЭЖХ применяют сорбенты с различными привитыми группами. Скорость движения подвижной фазы и эффективность разделения в ВЭЖХ значительно выше, чем в классическом варианте хроматографии.

2.1. Устройство жидкостного хроматографа

Классический прибор для ВЭЖХ (жидкостный хроматограф) состоит из следующих частей (рис. 1):

Рис. 1 Принципиальная схема жидкостного хроматографа

Подвижная фаза из емкостей для растворителей через фильтр подается насосом высокого давления в устройство для ввода пробы (туда же вводится проба). Далее образец с потоком подвижной фазы поступает в колонку. После процесса разделения элюат проходит через детектор, где происходит регистрация хроматограммы и передача данных в систему сбора и обработки хроматографических данных, и удаляется в сливную емкость.

Рассмотрим в указанной последовательности устройства отдельных блоков жидкостного хроматографа и требования, необходимые для их нормальной работы.

Подвижная фаза (элюент)

Требования, предъявляемые к элюенту:

 Элюент не должен содержать никаких твердых частиц и должен быть предельно химически чистым. Для приготовления подвижной фазы используются растворители марки «для ВЭЖХ». Это означает, что они были профильтрованы на фильтре с диаметром пор 0.2 мкм.

 Элюент должен быть освобожден от растворенных в нем газов – дегазирован, поскольку образование пузырьков может вызвать появление ложных пиков. Наиболее частые способы дегазации – пропускание через раствор элюента гелия (позволяет удалить до 80% растворенного воздуха) и вакуумная дегазация (удаляет около 60% воздуха).

Соблюдение этих правил увеличивает срок службы насоса и позволяет избежать загрязнения фильтров на входе в колонку.

Система подачи подвижной фазы

Для подачи потока элюента в колонку и детектор используются насосы, которые должны отвечать следующим требованиям:

• генерация давления до 15 МПа;

• слабые остаточные пульсации;

• химическая стойкость;

• обеспечение скорости потока от 0.1 до 10 мл/мин;

• воспроизводимость и контроль скорости потока с относительной погрешностью не более 0.5%.

По принципу действия насосы бывают шприцевые и плунжерные (возвратно-поступательные). В настоящее время в основном применяют плунжерные насосы. У них есть малая камера с клапаном, которая заполняется подвижной фазой и вновь опустошается при движении клапана вперед-назад. При этом создается поток с пульсациями, которые необходимо сглаживать. Шприцевые насосы работают без пульсаций, однако имеют серьезный недостаток – прерывание подачи подвижной фазы для заполнения цилиндра и промывки поршня. Их в основном используют в микроколоночной ВЭЖХ, так как в этом случае наблюдаются небольшие расходы элюента.

Существует два режима подачи элюента в хроматографическую колонку: изократический и градиентный. В случае изократичсекого режима состав элюента на протяжении всего хроматографического процесса остается постоянным. При градиентном элюировании состав элюента изменяется в процессе хроматографирования по специальной программе для достижения более эффективного разделения. Для осуществления градиентного элюирования в составе жидкостного хроматографа должно быть два насоса.

Следует отметить, что при использовании градиентного элюирования сокращается срок службы колонки. Это объясняется тем, что при изменении состава элюента, изменяется вязкость подвижной фазы, что, в свою очередь, приводит к изменению давления в системе, и колонки быстрее выходят из строя.

Система ввода пробы (инжектор)

Система ввода пробы должна обеспечивать введение объемов от 5 до 500 мкл. При этом в процессе ввода давление в системе должно оставаться постоянным. Основным типом устройства для ввода пробы является петлевой дозатор (рис. 2).

Рис. 2 Устройство петлевого дозатора для ВЭЖХ: а) заполнение дозирующей петли; б) ввод пробы в систему.

С помощью микрошприца раствор пробы через иглу поступает во входное отверстие петли 6-ходового крана. При этом элюент после насоса направляется непосредственно в колонку. При переключении крана определенный объем пробы поступает в систему под действием протекающего через петлю элюента. Затем кран переводится в исходное положение.

В некоторых хроматографах, таких как, например, «Миллихром», используется шприцевой дозатор, роль которого выполняет сам насос (при обратном ходе засасывается проба). Петлевые дозаторы являются более воспроизводимыми, чем шприцевые. Для выполнения большого количества серийных анализов используют автоматические системы ввода проб – автосэмплеры.

Хроматографическая колонка

Колонки представляют собой прямые трубки из нержавеющей стали, с внутренним диаметром 2 – 6 мм и длиной 100 – 250 мм. На верхнем и нижнем концах колонки расположены фильтры, представляющие собой диски из пористой нержавеющей стали. Назначение фильтров – удерживание сорбента в колонке и задержка механических примесей, которые могут находиться в подвижной фазе. Колонки заполнены сорбентом с размером частиц 5 – 10 мкм. Стандартные колонки имеют длину 250 мм и диаметр 4.6 мм и обеспечивают эффективность разделения до 50000 теоретических тарелок на 1 метр колонки. Для сокращения расхода высокочистых и дорогих растворителей часто используют микроколонки, с внутренним диаметром до 1 мм и длиной до 100 мм. В таких колонках используют сорбенты с размером частиц 3 мкм, что позволяет повысить эффективность до 100000 теоретических тарелок на метр колонки. Наиболее часто применяемые в ВЭЖХ колонки и их характеристики приведены в таблице 1.

Таблица 1	Сравнительная характеристика некоторых колонок для ВЭЖХ
Размер колонки, мм		Мертвый объем колонки, мл	Объем пика, мкл	Потребление элюента, мл	Сэкономленный элюент, %
4.6×250		2.5	550	18.9	0
4.6×150		1.5	430	11.4	40
3.0×250		1.06	240	8.0	58
3.0×150		0.64	188	4.8	74
2.1×150		0.3	94	2.4	87

Между инжектором и разделяющей колонкой может располагаться предколонка, представляющая собой небольшую колонку длиной 30 – 100 мм, заполненную, как правило, тем же сорбентом, что и разделяющая. Предколонка выполняет несколько функций. Во-первых, она задерживает мелкие частицы, которые могут попасть из насоса или компонентов пробы в разделяющую колонку и испортить ее, снизив эффективность и селективность. Во-вторых, на предколонке задерживаются сильно сорбируемые компоненты пробы, которые в случае их сорбции на разделяющей колонке было бы трудно элюировать. Таким образом, предколонка продлевает срок службы разделяющей колонки.