5.1.2. Методика получения плоскостной хроматограммы

Методика получения плоскостных хроматограмм включает в себя следующие этапы:

 Предварительный этап включает в себя подготовку пробы, подготовку пластины и подготовку хроматографической камеры и подвижной фазы.

Подготовка пробы. Обычно пробу готовят растворением анализируемой смеси в подходящем растворителе с таким расчетом, чтобы приблизительная концентрация раствора получилась в диапазоне 0.1 – 1%. Если необходима очистка пробы, то используют различные методы разделения и концентрирования (жидкостная экстракция, твердофазная экстракция, осаждение, возгонка и др.). Если в дальнейшем планируется количественное определение разделяемых веществ, то все растворы должны готовиться строго количественно (точная навеска, точный объем).

Подготовка пластины подразумевает:

• промывку, которая проводится для удаления промышленных загрязнений (выполняется элюированием пустой пластины в применяемой системе растворителей или в нейтральном растворителе);

• импрегнирование (если требуется по условиям анализа);

• активацию сорбента путем нагрева пластинки в сушильном шкафу при температуре 100 – 105°С в течение часа (активированные пластинки затем хранят в вакуум-эксикаторах).

Кроме того, перед нанесением пробы пластинку необходимо разделить на хроматографические зоны. Обычно на пластинке отражают линию «старта» с точками, на которые будут наноситься анализируемые пробы, и линию «фронта растворителя», до которой необходимо проводить элюирование. Количество проб, наносимых на пластинку, и высота линии «фронта растворителя» зависят от размера используемых пластин. Расстояние между пробами и расстояние от края пластинки до пробы желательно выдерживать не менее 1 см (для предотвращения смешивания проб или смыва проб с пластинки).

Подготовка хроамтографической камеры и подвижной фазы. В качестве хроматографической камеры может выступать любой герметично закрывающийся сосуд. Перед использованием камеру насыщают парами элюента. Под насыщением хроматографической камеры понимается такое ее состояние, при котором все компоненты подвижной фазы находятся в динамическом равновесии со всеми компонентами газовой фазы как до элюирования хроматографической пластинки, так и во время элюирования. Если камеру не насытить парами элюента, то при хроматографировании по мере подъёма фронта элюента, будет происходить его частичное испарение. Причём легче будет испаряться тот растворитель в многокомпанентном элюенте, который хуже адсорбируется, и давление паров которого меньше. Т. е. в процессе подъема фронта элюента будет меняться состав подвижной фазы и, следовательно, хроматографические характеристики будут неверны.

Время насыщения стандартной камеры (для пластинок 20 на 20 см) составляет приблизительно 2 – 2.5 часа в зависимости от состава подвижной фазы. Однако этот процесс можно существенно ускорить (до 0.5 – 1 часа), выложив внутренние стенки камеры фильтровальной бумагой, смоченной элюентом.

Рис. 13 Изменение положения и формы пятна при увеличении количества вещества, нанесённого на пластинку

 Нанесение исследуемой пробы на хроматографическую пластинку или бумагу проводят градуированным капилляром, микрошприцом или микропипеткой. В ВЭТСХ для нанесения пробы обычно используют платино-иридиевые капилляры, с помощью которых на пластинку наносится 100 – 200 нл. Кроме того, существуют автоматические раздаточные системы, позволяющие отмерять раствор пробы с высокой точностью.

Капля наносится касанием капилляра или иглы поверхности пластинки (но не надавливанием, так как при этом можно повредить слой сорбента!). Оптимальное количество исследуемого вещества (объём раствора), наносимого на пластинку, обычно определяется экспериментально. Если наносимое количество вещества слишком мало, то его можно не заметить при последующем проявлении. Нанесение на пластинку слишком большого количества вещества приводит к перегрузке сорбента и, как следствие, размыванию пятна и уменьшению величины R_f. (рис. 13). Диаметр пятна на линии старта для ВЭТСХ не должен превышать 1 – 1.5 мм, а в случае классической ТСХ он может варьировать от 2 до 4 мм.

 После нанесения исследуемых веществ на хроматографическую пластинку или бумагу, последние помещают в хроматографическую камеру и проводят хроматографирование. Уровень подвижной фазы в камере должен составлять не более половины от расстояния между нижним краем пластинки и линией «старта». Допускается ставить в камеру несколько пластинок, но оин при этом не должны соприкасаться. Все пластинки должны вноситься в камеру одновременно. После начала процесса хроматографирования недопустимо открывать крышку камеры, вытаскивать из камеры пластинки, перемещать камеру.

Обычно процесс хроматографирования ведут до тех пор, пока растворитель не поднимется на расстояние 10 см от линии старта. В зависимости от направления движения подвижной фазы различают следующие варианты плоскостной хроматографии (табл. 7).

Таблица 7	Способы получения плоскостных хроматограмм
Способ	Сущность способа
восходящая хроматография	Фронт подвижной фазы перемещается снизу вверх под действием капиллярных сил. Для получения хроматограммы используется наиболее простое оборудование - в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка. Наиболее часто используемый способ получения хроматограмм.
нисходящая хроматография	Фронт подвижной фазы перемещается сверху вниз в основном под действием сил тяжести. Для получения нисходящей хроматограммы в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой, из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель.
радиальная хроматография	Исследуемое вещество наносится в центр пластинки. Фронт подвижной фазы перемещается от центра к краю пластинки
двухмерная хроматография	После получения хроматограммы проводится повторное разделение в направлении, перпендикулярном исходному, с использованием подвижной фазы другого состава. Часто используется в бумажной хроматографии, например, в фармакогнозии при изучении состава лекарственных растений.

 После завершения процесса хроматографирования пластинку извлекают из хроматографической камеры и сушат. Высушенная пластинка представляет собой хроматограмму исследуемых веществ.