3.4. Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматографии) – это особая форма жидкостной хроматографии, в которой разделение молекул основано на различии в их размерах и частично в их форме.

Гель-хроматография своим названием обязана тому, что в качестве носителя неподвижной фазы используют различные сетчатые полимеры («гели»), которые в зависимости от свойств матрицы можно разделить на мягкие, полужесткие и жесткие.

Мягкие гели гидрофильны, поэтому при набухании они значительно увеличивают свой собственный объем. Процесс хромато­графирования на мягких гелях называется гель-фильтрационной хроматографией. Полужесткие и жесткие гели в основном гидрофобны. Про­цесс хроматографирования на таких гелях называется гель-прони­кающей хроматографией. Мягкие гели используют для разделения больших молекул (обычно высокомолекулярных соединений), в то время как полужесткие – для разделения веществ с низкой молекулярной массой. Жесткие гели используются в основном в высокоэффективном варианте гель-хроматографии.

Важной характеристикой гелей, от которой напрямую зависит способность разделения молекул, является диаметр пор. Поскольку создать гели с абсолютно идентичными по размерам порами практически невозможно, обычно гели характеризуют не одним размером пор, а распределением пор по размерам в определенном интервале, верхняя и нижняя границы которого составляют эксклюзионный диапазон. С диаметром пор связано такое понятие, как предел эксклюзии – значения относительных молекулярных масс, выше которых молекулы не удерживаются гелем. Данная величина зависит от диаметра пор геля и может принимать значения в диапазоне от 500 до нескольких миллионов.

Следует отметить, что разделение в большей степени осуществляется за счет различий в размерах и форме молекул, нежели за счет разницы в молекулярных массах, но между этими характеристиками существует определенная корреляция.

Перед использованием гели должны быть приведены в равновесное состояние (кондиционированы) путем контакта с подвижной фазой, которая будет применяться при дальнейшей работе. Этот процесс может занимать от нескольких часов до нескольких суток в зависимости от состава подвижной фазы.

Неподвижной фазой в эксклюзионной хроматографии является элюент, находящийся в порах зёрен твёрдого носителя, подвижной фазой – этот же элюент, протекающий вдоль слоя частиц полимера. Выбор растворителя зависит от типа используемого геля, вида разделяемых веществ, применяемой системы детектирования. Например, для разделения веществ на гидрофильных гелях используют водные элюенты, в состав которых, как правило, входит буфер для контроля уровня рН. В случае гидрофобных гелей в качестве элюента используются неполярные органические растворители, такие как ТГФ, дихлорметан, толуол.

Для детектирования в аналитической гель-хроматографии применяют рефрактометрический или фотометрический детекторы. Для высокомолекулярных веществ в качестве специального детектора может быть использован визкометр.

В отличие от всех других методов жидкостной хроматографии, гель-хроматография не основана ни на каком-либо физическом или химическом взаимодействии с неподвижной фазой. Удерживание молекул определяется диффузией в поры геля и зависит как от размера молекул, так и от размера пор твердого носителя.

В процессе хроматографирования молекулы, имеющие больший размер, чем максимальный диаметр пор набухшего геля, не способны проникать в его частицы и, следовательно, свободно проходят через колонку в пространстве между частицами. Меньшие же по размеру молекулы будут в различной степени проникать внутрь пор сорбента в зависимости от их размера и формы, причем, чем меньше размер молекул, тем больше вероятность этого проникновения. Следовательно, молекулы будут по-разному удерживаться в колонке и элюироваться в порядке уменьшения размеров (рис. 12).

Рис. 12 Принцип эксклюзионной хроматографии

Величина коэффициента распределения D в эксклюзионной хроматографии может находиться в пределах от 0 до 1.

Данное утверждение справедливо лишь в тех случаях, когда на механизм распределения не накладываются другие взаимодействия, например, адсорбция или ионный обмен.

Для крупных молекул, не способных проникать в поры геля, D = 0, следовательно, удерживаемый объём V_R равен свободному объёму колонки V_М. В случае молекул, размер которых позволяет им свободно диффундировать через пористый материал, D = 1 (поскольку состав подвижной и неподвижной фаз одинаков), следовательно, удерживаемый объём равен сумме свободного объёма колонки и объёма жидкости, находящейся в порах – V_R = V_М + V_S. Для молекул промежуточного размера удерживаемый объем находится в интервале от V_М до (V_М + V_S). Следовательно, методом гель-хроматографии можно разделить лишь те молекулы, размеры которых попадают в эксклюзионный диапазон. Для таких молекул значение коэффициента распределения больше нуля, но меньше единицы: 0 < D < 1.

К преимуществам эксклюзионной хроамтографии относят то, что проба, как правило, не вступает ни в какие химические или физические взаимодействия, и поэтому ее компоненты элюируются без потерь. Кроме того, проба не влияет на разделяющую колонку, как это происходит в других видах жидкостной хроматографии.

Недостатком же гель-хроматографии является узкий диапазон эксклюзии (значения D от 0 до 1) вследствие чего пиковая емкость ограничена. Поэтому для эффективного разделения в данном виде хроматографии приходится применять длинные колонки или несколько соединённых друг с другом колонок. Более того, не могут быть разделены вещества близкого размера, например, изомеры. Считается, что разделение может быть успешным только при различии молекулярных масс как минимум на 10%.

Основное назначение гель-хроматографии – разделение смесей высокомолекулярных соединений (а также высокомолекулярных и низкомолекулярных) и определение молекулярно-массового распределения полимеров. Особое место занимает решение аналитических и препаративных задач биохимии, таких как очистка противовирусных препаратов.