ДНК-чипы

Трансгенные животные

Саузернблоттинг

Разделение фрагментов ДНК

(гель-электрофорез)

Перенос в щелочной раствор

для полученияоднонитевых

фрагментов ДНК.

Перенос на нитроцеллюлозную

или нейлоновую мембрану

Гибридизация со

специфической меченой пробой ДНК

Выявление полос меченого зонда ДНК путем

экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография),

Зонды, меченые флюорохро- мом, выявляют при помощи люминесцентной микроскопии.

Саузернблоттинг

Нозернблоттинг

Применяют для выявления

и гибридизации РНК

(фрагментов РНК).

Размер и количество

специфических молекул

иРНК определяется после

обработки общей РНК или

поли (А) РНК.

Молекулы РНК выделяют

гель-электрофорезом и

переносят на

иммобилизованную

мембрану.

Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой пробой.

Типы блоттингов

ДНК-ДНК-гибридизация

Денатурация, т.е. разделениу двунитевой ДНК на отдельные нити в щелочной среде (90°С)

Восстановление (отжиг) двунитевой структуры с комплементарной меченой нитью ДНК (молекулярным зондом) (10-37°С).

Гибридизацию проводят на фильтрах (блот-

гибридизация) или in situ. Молекулярный зонд с присоединенным биотином гибридизируется на ДНК

мишени.

После отжига и промывки на образец наносят антибиотиновый конъюгат (стрептавидин, соединенный со щелочной фосфатазой) и проводят специфическое окрашивание клеток.

Стрептавидин с меткой избирательно связывается с биотином, что выявляется при микроскопии. Так выявляют локализацию микробов в ткани, хромосомные аномалии в клетках и т.д.

Риботипирование

Выявление количественных различий по рибосомным оперонам и нуклеотидным последовательностям.

Проводят гидролиз ДНК, которую разделяют в агарозном геле и затем гибридизируют с

ДНК-зондами на один или более генов,

кодирующих 16S-, 23S-, 5S-рибосомные РНК.

Бактерии можно типировать по серотипу,

фаготипу и по риботипу. Методически сходно

с риботипированием S-типирование:

проводят сравнительный анализ числа копий S-элементов и рестрикционного разнообразия нуклеотидных

последовательностей различных штаммов микробов.

Рестрикционный анализ

ДНК расщепляют с помощью рестриктаз (бактериальных эндонуклеаз)/

Отдельные рестриктазы способствуют выделению строго определенных фрагментов ДНК. Размер полученных фрагментов ДНК можно определить путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

После электрофореза каждый фрагмент ДНК располагается в определенном участке геля в виде дискретной полосы. Фрагменты ДНК выявляют путем обработки геля бромидом этидия, который связывается с ДНК.

Такие фрагменты ДНК высвечиваются при ультрафиолетовом облучении в красной области спектра. Длину каждого фрагмента можно выявить, сравнивая расстояние, пройденное фрагментом ДНК при электрофорезе, с расстоянием, пройденняым стандартным фрагментом ДНК известного размера.