2.3. Дослідження ауксотрофності

Дослідження ауксотрофності здійснювали згідно методики [58], модифікованої для потреб бактеріальних продуцентів та поживних середовищ.

Для визначення ауксотрофності штамів використовували бактеріальну суспензію, яку готували таким чином: відбирали дводобову культуру з штрихових культур МПАзб., яку розводили у стерильному фізіологічному розчині до концентрації 1х10⁵ КУО/дм³, що відповідало 0,5 оптичної густини (ОГ). ОГ вимірювали за допомогою фотоелектроколориметра (модель КФК-3) в кюветах з товщиною між стінками d=5 мм (довжина хвилі 440 нм).

Отриманий інокулят переносили стерильно в: а) МПАзб., б) МС, в) МС з амінокислотою (МС+лейцин або гомосерин) та відповідним антиметаболітом (МС+β-оксинорвалін (НВ), МС+аміноетилцистеїн (АЕЦ); г) мелясне середовище.

Після стерилізації вносили стерильну крейду в кількості 10 г/дм³ для створення буферності середовища в процесі метаболізму бактерій. Глибинне культивування здійснювали в колбах Ерленмейєра об’ємом 0,25 дм³ з поживним середовищем об’ємом 0,03 дм³ в шейкері-інкубаторі “BIOSAN” ES-20 протягом трьох-чотирьох діб за температури 31±1°С і при частоті обертання 240 хв^-1. Ауксотрофність визначали за наявністю росту бактерій на вибраному середовищі [158, 159].

2.4. Дослідження впливу мутагенних факторів на штами-продуценти лізину та треоніну

2.4.1. УФ мутагенез. Згідно з методикою [45] проведено мутагенез УФ опроміненням (використовували дві лампи «Phillips» потужністю 30 Вт кожна, λ=254 нм, відстань до об’єкту опромінення – 0,12 м) бактеріальних суспензій за кімнатної температури протягом 60 – 720 с з інтервалом 60 с. Опромінену бактеріальну суспензію розсівали у різних розведеннях (від початкової концентрації суспензії до розведення 10^-6) на мінімальне середовище з амінокислотами та аналогом цільової амінокислоти [11].

Інкубацію здійснювали в термостаті за температури 31±1°С протягом трьох діб. Всі колонії, що були ауксотрофними до лейцину та гомосерину та виросли на МС з амінокислотами та на МС з аналогами амінокислот, перевіряли щодо продукування лізину та треоніну. Найбільш продуктивні клони відбирали для наступних етапів та подальших досліджень.

Мутагенез здійснювали на установці (рис. 2.1) згідно схеми, що представлена на рис. 2.2.

Рис. 2.1 Установка для опромінення бактеріальної культури УФ світлом

Рис. 2.2 Загальна схема мутагенезу продуцентів лізину та треоніну

2.4.2. Хімічний мутагенез. Бактеріальну суспензію (титр клітин 10⁶ – 10⁷) готували на стерильному фізіологічному розчині. Суспензію вибраних клонів витримували на шейкері (220 хв^-1) за температури 30-32 °С протягом 5-30 хв у Трис-малат буфері (рН 6,0), що містив від 100 до 500 μg/дм³ NTG. Потім клітини промивали у 0,1 М Трис-фосфатному буфері з рН 7,2. Бактеріальну суспензію, отриману методом розведень, розсівали на чашки Петрі на МС з аналогом лізину – АЕЦ або треоніну – НВ.

Визначали вплив хімічних мутагенних факторів на життєздатність клітин бактерій. Кількість клітин, що виживали, визначали за кількістю колоній штамів бревібактерій, що виросли на МПАзб. [137].