4.2. Вплив хімічного мутагенезу (ntg) на штами-продуценти
Для подальшого збільшення накопичення лізину та треоніну було проведено дослідження впливу хімічного мутагенезу на вихідні штами Brevibacterium sp. 90, Brevibacterium sp. 90H, Brevibacterium sp. E531, Brevibacterium flavum TH7 та отриманий під дією УФ-опромінення мутантний штам-продуцент лізину Brevibacterium sp. IMB B-7447.
Визначали вплив NTG на життєздатність клітин бактерій. Кількість клітин, що виживали, визначали за кількістю колоній бревібактерій, що виросли на середовищі МПАзб.
Життєздатність клітин під дією NTG змінювалась в залежності від терміну дії і концентрації мутагену. При дії NTG в концентрації 200-500 μg/дм3 на 2-й хвилині не залишалось жодних життєздатних клітин (рис. 4.3). Була встановлена для мутагенезу оптимальна концентрація NTG – 100 μg/дм3. На МПАзб. виростали колонії різного забарвлення (без пігментів, жовті, рожеві) та різних розмірів (рис. 4.4). Після оброблення NTG мутантного штаму Brevibacterium sp. IMB B-7447 отримали рожеві колонії, які також були відібрані для подальшого визначення накопичення лізину та треоніну.
Рис. 4.3 Життєздатність клітин Brevibacterium під дією NTG
Критерієм відбору мутантів була ауксотрофність та стійкість до аналогу лізину АЕЦ. З популяції виживших клітин у невеликих розведеннях виявлено мутантні клони.
Після 3-х діб культивування отриманих мутантних штамів на мелясному середовищі визначали вміст лізину та треоніну. Варто зазначити, що отримані мутанти синтезували амінокислоти у тій же кількості, що і вихідні штами. А пігментовані рожеві колонії швидко «повертались» до початкового жовтого забарвлення (протягом декількох генерацій), що свідчило про не стабільність мутаційних змін. Аналогічні результати були отримані і в роботі [181]. Тому подальші дослідження з мутантними штамами, отриманими при дії NTG, не проводили.
Рис. 4.4 Колонії на МПАзб. після оброблення NTG мутантного штаму Brevibacterium sp. IMB B-7447 (збільшення 40х)
4.3. Здійснення уф-мутагенезу штаму-продуценту треоніну
На першому етапі дослідження було визначено вплив УФ-опромінення на життєздатність клітин штаму B. flavum ТН7. Як контроль брали відповідні розведення неопроміненої суспензії бактерій. Життєздатність клітин встановлювали до та після УФ-опромінення бактеріальної суспензії. Кількість клітин в популяції, що виживали, визначали за кількістю утворених колоній на МПАзб. і залежно від тривалості дії УФ-опромінення. Контролем слугувала неопромінена бактеріальна суспензія.
Для визначення летальної дози штам B. flavum ТН7 опромінювали протягом 12 хв. Для мутагенезу був визначений оптимальний термін опромінення – 10 хв (рис. 4.5).
Рис. 4.5 Життєздатність клітин B. flavum ТН7 під дією УФ-опромінення
Примітка. Контролем слугував показник КУО (100%) в неопроміненій бактеріальній суспензії
Критерій відбору мутантів – ауксотрофність та стійкість до аналогу треоніну НВ. З популяції виживших клітин у невеликих розведеннях виявлено мутантні клони. Серед всіх клонів, отриманих дією УФ на клітини B. flavum ТН7, для подальшого дослідження відібрали 8 та перевірили їх на накопичення цільової амінокислоти (рис. 4.6). Отримані мутантні штами показали підвищення рівня наукопичення треоніну більш ніж в 2 рази.
Аналіз регуляторної та аналогорезистентної ауксотрофності і відбір мутантів. Стійкість до аналогів амінокислот можуть викликати мутації, які блокують надходження амінокислот до клітини. Було проведено декілька етапів селекції, використовуючи поступове підвищення концентрації НВ від 0,25 мг/дм3 до 0,4 мг/дм3.
* *
Рис. 4.6 Накопичення треоніну мутантними штамами B. flavum ТН7
Примітка: 1 – штам до опромінення УФ; 2-9 – отримані УФ-мутанти.
Контролем слугував показник синтезу треоніну штамом до опромінення.
Опромінену бактеріальну суспензію висівали глибинним способом на МПАзб. (для встановлення титру клітин), МС з лейцином або гомосерином, та з НВ (для відбору мутантів за критеріями ауксотрофності та аналогорезистентності). Отримані результати представлено в табл. 4.4. Відбір мутантів здійснювали за критеріями ауксотрофності та стійкості до НВ продуцентів треоніну. Отримано НВ-стійкі продуценти треоніну з частотою мутацій (1,4±0,2)x10-3.
Таблиця 4.4