Журнал неврологии и психиатрии / 2006 / NEV_2006_01_01

спорадической БДН идентичны. Несмотря на многолетние исследования, генетическая природа БДН до конца не уточ- нена.

Важным элементом патогенеза БДН является повышенная продукция свободных радикалов, которые повреждают мотонейроны [35]. Известно, что важную роль в поддержании нормального уровня свободных радикалов играет супероксиддисмутаза (СОД-1) [44]. Мутации в гене СОД-1 обнаружены в 20% случаев семейной БДН и в небольшом проценте спорадических случаев [5, 6]. Мутации СОД-1 обнаружены и у больных в Российской Федерации [2].

Свободные радикалы, в частности, образуются в ходе процессов детоксикации, впоследствии преобразуясь в нетоксичные продукты. Детоксикация играет ключевую роль в метаболизме ксенобиотиков, в том числе большинства препаратов и токсичных соединений окружающей среды [9], из которых многие могут принимать участие в дегенерации нейронов. Пути детоксикации ксенобиотиков включают их инактивацию в фазе I и инактивацию высокотоксичных промежуточных метаболитов в фазе II. Суперсемейство генов цитохромов-450 (CYP) (фаза I) и глутатион-S-транс- фераз, а также ариламин-N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) (фаза II) играют основную роль в этих процессах биотрансформации.

Цитохромы (CYPs) представляют суперсемейство ферментов, отвечающих за окисление, перекисное окисление и восстановление эндогенных и экзогенных веществ. Семейство цитохромов CYP1—3 активно метаболизирует широкий спектр ксенобиотиков и играет важную роль в защите организма от их воздействия [21]. Изменения активности CYP могут привести к усилению индивидуальной восприимчивости к действию как эндогенных, так и экзогенных токсинов. Некоторые цитохромы, такие как CYP2E1, CYP2D6, CYP2A1 и CYP1A2, могут участвовать в патогенезе неврологических заболеваний [11, 17, 51, 56].

Цитохром CYP2E1 (этанолиндуцибельный фермент) катализирует окисление более 75 ксенобиотиков, в том числе этанол, лекарственные препараты и некоторые потенциальные канцерогены [33]. CYP2E1 обладает уникальным свойством преобразовывать многие ксенобиотики в их токсич- ные метаболиты; часто это свободные радикалы, которые предположительно задействованы в патогенезе БДН [38]. Недавно был описан инсерционный полиморфизм размером 96 пар оснований (п.о.) — CYP2E1*1D в промоторе гена CYP2E1, локализующийся между –2270 и –1672 позициями [35]. Частота этого полиморфизма в этнических группах колеблется от 2% у европеоидов до 10% у американских негров [18]. Он часто наблюдается у детей, страдающих перинатальной патологией, связанной с алкоголизмом матери [39]. Инсерционный полиморфизм CYP2E1 ассоциирован с повышенным риском развития инфильтративного туберкулеза легких [10]. Генотипы, содержащие инсерцию, ассоциированы с превышением нормы активности фермента [38]. Такое возрастание индуцированной активности фермента, вероятно, стимулирует образование свободных радикалов и нейротоксичных метаболитов. Поэтому можно предположить, что данный полиморфизм ассоциирован с повышенным риском развития БДН.

Другим цитохромом, который может участвовать в различных патологических процессах, является дебризокин-4- гидроксилаза (CYP2D6). Она метаболизирует широкий спектр ксенобиотиков (лекарственных препаратов, металлов, а также химикатов, образующихся в природе или на производствах). Примерно у 5—10% европеоидов отмечается снижение функции этого фермента — фенотип «медленной метаболизации» (MM) [29]. Этот фенотип ассоциирован с широким спектром заболеваний, включая рак [62], болезни Паркинсона [54] и Альцгеймера [13]. Существует по крайней мере 30 дефектных аллелей CYP2D6, из которых 6 лежат в основе 95—99% фенотипов MM [29]. Одним из наиболее полно охарактеризованных вариантов является аллель

CYP2D6*4, возникающий в результате замены гуанина на аденин на границе 3-го интрона и 4-го экзона гена [22]. Гомозиготность по аллелю CYP2D6*4 лежит в основе 75% фенотипов ММ [53]. Из нескольких исследований по изуче- нию ассоциации полиморфизма CYP2D6*4 с развитием БДН

âодном [30] частота встречаемости гомозигот по CYP2D6*4 среди больных с БДН не отличалась от контроля, тогда как

âдругом [56] была повышена, а частота фенотипа ММ повышенной не была, и это дало основание полагать, что наличие аллеля CYP2D6*4 может быть фактором риска развития БДН.

Метаболиты фазы I детоксикации, образуемые цитохромами, часто потенциально более вредны, чем исходные вещества, и важно, чтобы они не накапливались. Ферменты фазы II инактивируют эти промежуточные метаболиты, катализируя их связывание с кофакторами, которые превращают их в гидрофильные формы, что облегчает выведение таких метаболитов [48]. Наиболее важными участниками фазы II являются глутатион-S-трансферазы (GSTs) — полигенное суперсемейство изоферментов, широко представленное в животном мире [37]. Первичной их функцией является детоксикация, которая опосредована конъюгацией большого количества электрофильных соединений с восстановленным глутатионом (GSH) [47]. У человека обнаружены различные изоферменты GST, ряд которых обладает

тканеспецифичной экспрессией [61]. Известно по крайней мере 7 семейств растворимых GSTs: α, µ, π1, σ, θ, κ, ξ [31]. Отдельные GSTs полиморфны, и некоторые аллельные ва-

рианты их генов обусловливают снижение активности ферментов. Глутатион-S-трансферазы θ1 (GSTT1), µ1 (GSTM1) и π1 (GSTP1) представляют наибольший интерес. Известны делеционные, или «нулевые», аллели генов GSTT1 и GSTM1, которые определяют невозможность экспрессировать белок [55]. Они встречаются часто — «нулевые» генотипы GSTT1 и GSTM1 (0/0) имеются у 10—20 и 40—65% европеоидов соответственно [50]. Ген GSTP1 имеет несколько полиморфизмов. Функционально значимой является замена аденина на

гуанин в 5-м экзоне гена, которая приводит к замене изолейцина на валин в 105-м кодоне (105 Ile→Val). Она обусловливает изменение термоустойчивости и специфической активности валинсодержащей изоформы [24, 65]. Считают, что эти варианты GST увеличивают восприимчивость человека к различным заболеваниям, в том числе к хроническому бронхиту, разным видам рака [26] и к неврологической патологии [59].

Другим важным участником фазы II является ариламин- N-ацетилтрансфераза типа 2 (NAT2), катализирующая N-ацетилирование ксенобиотиков с первичной ароматиче- ской или гидразиновой структурой [27], например токсич- ные нитрозамины табачного дыма, антиоксиданты и пестициды. NAT2 участвует в метаболизме лекарств, в том числе в лекарственных взаимодействиях [9, 57]. Способность NAT2 N-ацетилировать различные ксенобиотики связана с полиморфизмом гена NAT2. В зависимости от вариантов активности последнего всех людей можно разделить на две группы — медленных (МА) и быстрых (БА) ацетиляторов. МА гомозиготны по рецессивным формам гена NAT2, имеют два «медленных» аллеля, и уровень экспрессии белка NAT2 у них снижен на 20%. БА имеют по крайней мере один из «быстрых» аллелей NAT2 дикого типа [14]. Примерно 50% европеоидов являются МА, но представленность БА и МА различна в зависимости от географического региона [15]. Проведен ряд исследований, в ходе которых установлено, что полиморфизмы ацетилирования ассоциированы с развитием различных заболеваний, в частности некоторых видов рака [4, 28, 34, 64] и неврологических, например болезни Паркинсона [7].

Эти данные, а также тот факт, что у больных с хрони- ческими неврологическими заболеваниями, по-видимому, имеет место снижение способности детоксицировать определенные экзогенные соединения [58, 62], дают основание

ОБЩИЕ ВОПРОСЫ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ

полагать, что гены системы детоксикации могут быть косвенно вовлечены в патогенез БДН.

Цель настоящего исследования состояла в проверке высказанной гипотезы, согласно которой гены системы детоксикации вовлекаются в патогенез БДН. Нами проведен сравнительный анализ распределения вариантов генотипов CYP2E1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, GSTP1 и NAT2 у пациентов с БДН и в контрольной группе.

Материал и методы

После информированного согласия пациентов образцы крови были взяты у 75 проживающих в Российской Федерации (средний возраст 55,5±10,9 года), у которых предполагалось наличие спорадической БДН.

Больные были обследованы на кафедре фундаментальной и клинической неврологии РГМУ. В соответствии с классификацией F. Norris и соавт. [46] их разделили на группы БАС и прогрессирующего бульбарного паралича (ПБП) (табл. 1).

Типы прогрессирования оценивали по шкале F. Norris и соавт. [45] в ходе динамического наблюдения каждые 6 мес вплоть до смерти больного. Пациенты с быстрым прогрессированием теряли за 6 мес более 10 баллов, со средним прогрессированием — от 5 до 10 баллов, с медленным — менее 5 баллов. Согласно данным регрессионного анализа, быстрый, средний и медленный типы прогрессирования достоверно различались: соответственно r=–0,96, p<0,001; r=–0,97, p<0,001; r=–0,98, p<0,001.

Контрольную группу составили 105 жителей Москвы, не находившихся между собой в родстве; она была сопоставима по полу, возрасту и национальности с основной группой.

Таблица 1. Клинические характеристики больных с БДН

6

ДНК выделяли из лейкоцитов стандартными методами [40].

Генотипирование CYP2E1. Наличие инсерции 96 п.о. в промоторе гена CYP2E1 устанавливали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [18]. Использовали праймеры 5'-GTGATGGAAGCCTGAAGAACA-3' и 5'-CTTTGGT GGGGTGAGAACAG-3'. ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 5 пмоль каждого праймера, 2 мкл 10½ПЦР буфера (500 ммоль трис-НСl, рН 8,8, 150 ммоль (NH4)2SO4, 50 ммоль MgCl2, 2 мг/мл альбумина телячьей сыворотки), 1,0 ммоль каждого динуклеотидтрифосфата (дНТФ) и 0,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas). Условия ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин, далее 30 циклов при 95°С в течение 1 мин, при 66°С в течение 1 мин и при 72°С в течение 1 мин. Продукты ПЦР растворяли в 8% полиакриламидном геле, окрашенном бромидом этидия. Длина фрагмента, соответствующего аллелю без инсерции и содержащего 6 повторов в области 5'-конца (CYP2E1*1C), составляла 633 п.о., длина фрагмента, соответствующего аллелю с инсерцией и содержащего 8 повторов в области 5'-конца (CYP2E1*1D), — 729 п.о.

Генотипирование СYР2D6. Применяли метод генотипирования по М. Brown и соавт. [12]. Он позволяет отличить аллели CYP2D6*4 от других аллелей CYP2D6 при помощи ПЦР и рестрикционного теста с использованием рестриктазы BstNI. Этот фермент разрезает аллель дикого типа в положении 1934, но не реагирует с мутантными аллелями. Положение 5' ПЦР-праймера было изменено, чтобы вклю- чить неполиморфный сайт рестрикции BstNI в положении 1772. Смесь для реакции амплификации содержала 5 пмоль каждого праймера (5'-GGTGTTCCTCGCGCGCTATG-3' и 5'- CTCGGTCTCTCGCTCCGCAC-3'), 2 мкл 10½ПЦР-буфера, 1,0 ммоль каждого дНТФ и 0,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas). Условия ПЦР: денатурация при 95°С в те- чение 5 мин, затем 30 циклов при 95°С в течение 1 мин, при 65°С 1 мин и при 72°С 1 мин. Продукты рестрикции экстрагировали с помощью аликвот ПЦР-продуктов объемом 10 мкл (длиной 421 п.о.) и 1 ед. MvaI (изошизомер BstNI; MBI Fermentas) и инкубировали при 37°С в течение ночи. Продукты рестрикции подвергали электрофорезу в 8% полиакриламидном геле и визуализировали путем окраски бромидом этидия и ультрафиолетового облучения. Гомозигот по CYP2D6*4 диагностировали по наличию двух полос длиной 77 и 344 п.о., а гомозигот — по аллелям, отличным от CYP2D6*4, по наличию трех полос длиной 77, 161 и 183 п.о.

Генотипирование GSTM1 и GSTT1. Гомозиготные делеции генов GSTM1 и GSTT1 определяли с помощью методик множественной ПЦР с праймерами для 4-го экзона гена ГТФ- циклогидролазы-1 (ГЦГ-1) в качестве внутреннего контроля [3]. ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 10½ПЦР-буфера, 1,0 ммоль каждого дНТФ, 0,5 ед. Таq ДНК-полимеразы (MBI Fermentas) и 5 пмоль каждого праймера (ген GSTM1: 5'-GAACTCCCTGAAAA GCTAAGC-3' и 5'-GTTGGGGCTCAAATATACGGTGG-3'; ген GSTT1: 5'-ТТССТТАСТGGТССТСАСАТСТС-3' и 5'-TCACCGGATCAG GCCAGCA-3'; 4-й экзон гена ГЦГ-1: 5'-GTCCTTTTTGTTTTAT GAGGAAGGC-3' и 5'-GGTGATGCACTCTTATAATCTCAGC-3'). Условия ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов при 95°С в течение 1 мин, при 63°С 1 мин и при 72°С 1 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле и визуализировали путем окраски бромидом этидия и ультрафиолетового облучения. Наличие или отсутствие генов GSTT1 и GSTM1 определяли по наличию или отсутствию полос длиной 480 п.о. или 215 п.о. соответственно. Наличие полосы длиной 297 п.о. (4-й экзон гена ГЦГ-1) означало, что амплификация прошла успешно. Данный метод не позволяет различить гетеро- и гомозиготный фенотипы, но лишь убедительно выявляет «нулевые» генотипы.

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 1, 2006

Генотипирование GSTP1. Полиморфизм Ile105Val в 5-м экзоне гена GSTP1 выявляли с помощью ПЦР и рестрикционного анализа [63] с праймерами 5'-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3' и 5'-AGCCAACCTGAGGGGTAAG-3'. Смесь для реакции амплификации содержала 2 мкл 10½ПЦР-буфера, 1,0 ммоль каждого дНТФ, 5 пмоль каждого праймера и 0,5 ед. Таq ДНКполимеразы (MBI Fermentas). Условия ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов при 95°С по 1 мин, при 65°С в течение 1 мин и при 72°С 1 мин. Продукты рестрикции экстрагировали с помощью аликвот ПЦР-про- дуктов объемом 10 мкл и 1,5 ед. Alw26I (изошизомер BsmAI; MBI Fermentas), инкубировали при 37°С в течение ночи. Фрагменты рестрикции растворяли при помощи электрофореза в 8% полиакриламидном геле и визуализировали путем окраски бромидом этидия и ультрафиолетового облучения. Длина фрагмента аллеля GSTP1*А, содержащего изолейцин в 105-м кодоне, составляла 320 п.о., фрагмента аллеля GSTP1*B, содержащего валин в 105-м кодоне, — 222 п.о.

Генотипирование NAT2. Полиморфизм гена NAT2 изуча- ли, как было описано ранее [8, 60]. Выявляли три наиболее распространенных «медленных» аллеля — S1, S2 и S3 (NAT2*5, NAT2*6 и NAT2*7 соответственно) и один «быстрый» аллель дикого типа — F1 (NAT2*4). Амплификацию при ПЦР проводили с праймерами 5'-GCTGGGTCT GGAAGCTCCTC-3' и 5'-TTGGGTGATACATACACAAGGG-3' в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл 10½ПЦР-буфера, 1,0 ммоль каждого дНТФ, 5 пмоль каждого праймера и 0,5 ед. Таq ДНКполимеразы (MBI Fermentas). Условия ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 95°С в течение 1 мин, при 57°С 1 мин и при 72°С 1 мин. Продукты амплификации обрабатывали рестриктазами КрnI (для выявления аллеля NAT2*5 [S1]), TaqI (для выявления аллеля NAT2*6 [S2]) и ВаmHI (для выявления аллеля NAT2*7 [S3]). Фрагменты рестрикции растворяли при помощи электрофореза в 8% полиакриламидном геле и визуализировали путем окраски бромидом этидия и ультрафиолетового облучения.

Статистическая обработка. Для анализа таблиц сопряженности применяли Statistica software 6.0 и программу R½C; для определения величины р без погрешности пользовались алгоритмом Метрополиса [49].

У больных и лиц контрольной группы рассчитывали уравнение Харди — Вейнберга для генотипов CYP2E1, CYP2D6, GSTP1 и NAT2, чтобы определить, соответствует

ГЕНЕТИКА БОЛЕЗНИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕЙРОНА

ли распределение аллелей ожидаемому (генотипы GSTM1 и GSTT1 обозначали как «дикий» или «нулевой», что не позволяло провести прямое вычисление уравнения Харди — Вейнберга). Различия в распределении генотипов анализированных генов у пациентов и лиц контрольной группы оценивали с помощью критерия χ2. Анализ ассоциации между генотипами и клиническими характеристиками проводили с помощью непараметрических ранговых корреляций (γ или Спирмена).

Результаты

Полиморфизм гена CYP2E1. Результаты генотипирования CYP2E1 представлены в табл. 2. Необходимо отметить, что мы выявляли только аллель CYP2E1*1C, несущий 6 повторов в промоторной области, а также инсерционный аллель — CYP2E1*1D, несущий 8 повторов, но не аллель дикого типа CYP2E1*1А, несущий только 5 повторов. Аллель CYP2E1*1D встречался редко, особенно в контрольной группе, и разли- чий в его частоте между контрольной группой (2,5%) и популяцией европеоидов не выявлено (2%) [18]. Однако достоверные различия были установлены между группой контроля и пациентами с БДН. При БДН частота аллеля CYP2E1*1D была достоверно выше (14% при 2,5% в контроле; р<0,001). Анализ распределения генотипов не выявил генотипа CYP2E1*1D/ CYP2E1*1D в контрольной группе. Эти данные согласуются с результатами исследования популяции европеоидов [18]. Сравнительный анализ распределения генотипов выявил достоверные различия между группой больных и контролем в обследованной нами российской популяции (р=0,0018). Отмечалось достоверное увеличение частоты гомозиготных носителей аллеля CYP2E1*1D в группе БДН (см. табл. 2). Распределение генотипов соответствовало уравнению Харди

— Вейнберга. Поскольку генотипы, содержащие инсерцию, приводят к повышению активности фермента [38], мы объединили гетерозиготных носителей аллеля CYP2E1*1D (а) и гомозиготных носителей аллеля CYP2E1*1D (б) в один генотип. Частота комбини-

рованного генотипа CYP2E1 (а+б) также достоверно преобладала у больных по сравнению с контролем (р<0,001).

Проанализировали ассоциацию аллеля CYP2E1*1D с развитием болезни. Исследовали корреляцию между наличием комбинированного генотипа CYP2E1 и различными клиническими характеристиками, приведенными в табл. 1. Корреляция была установлена только между формой/дебютом БДН и наличием комбинированного генотипа (γ-корреляция: r=2,838, p=0,005; корреляция Спирмена: r=0,4, p=0,033). Дальнейший анализ показал, что генотип CYP2E1*1С/ CYP2E1*1С ассоциирован с шейным дебютом БАС, тогда как наличие аллеля CYP2E1*1D достоверно коррелировало с более злокачественными формами БДН

— грудным и диффузным дебютами БАС и ПБП (χ2=3,85; ð=0,0492).

П о л и м о р ф и з м г е н а C Y P 2 D 6 . Частоты аллеля

CYP2D6 и его генотипов у больных с БДН и в контрольной группе приведены в табл. 3. Достоверных различий в частотах между российской и британской европеоидной контрольными группами выявлено не было. Например, частота гомозиготных носителей аллеля CYP2D6*4 составила 4%, как и в исследовании М. Brown и соавт. [12]. Частоты генотипов в основной и контрольной группах соответствовали уравнению Харди — Вейнберга.

Несмотря на ранее показанную ассоциацию между развитием БАС и наличием аллеля CYP2D6*4 [55], прямое сравнение с помощью критерия χ2 частот и генотипов аллеля CYP2D6 не выявило достоверных различий между группами больных с БДН и контролем в российской популяции (см. табл. 3). Однако количество гомозиготных носителей аллеля CYP2D6*4 в группе больных с БДН было повышено.

Поскольку гомозиготность по аллелю CYP2D6*4 приводит к фенотипу ММ [53], мы объединили гомозигот без аллеля CYP2D6*4 (а) и гетерозигот по аллелю CYP2D6*4 (б) в один генотип. Сравнительный анализ распределения комбинированного генотипа CYP2D6 (а+б) и гомозигот по аллелю CYP2D6*4 выявил достоверные различия между больными с БДН и контрольной группой (см. табл. 3). Гомозиготность

по аллелю CYP2D6*4 достоверно чаще отмечалась в группе БДН (р=0,04).

При изучении распределения комбинированного генотипа CYP2D6 у больных с разными клиническими характеристиками, как и при анализе аллеля CYP2E1, достоверных корреляций генотипов CYP2D6*4 полиморфизма с этими показателями обнаружено не было.

Полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1. Частоты генотипов GSTT1 и GSTM1 в группе БДН и в контроле представлены в табл. 4. Необходимо отметить, что метод изучения полиморфизмов данных генов позволял убедительно судить лишь о наличии «нулевых» генотипов GSTT1(0/0) и GSTM1(0/0). Гетеро- и гомозиготные носители нормальных аллелей были объединены и проанализированы как генотипы GSTT1(+) или GТМ1(+).

Наблюдавшиеся частоты гомозиготных делеций GSTT1 и GSTM1 в контрольной популяции согласовывались с результатами других исследований в популяции европеоидов [8, 50, 57]. Доля носителей «нулевого» генотипа GSTT1 была значительно ниже частоты генотипа GSTM1(0/0) и сопоставима в обеих группах (см. табл. 4). Результаты анализа частоты генотипа GSTT1(0/0) отличались от таковых в исследовании М. Stroombergen и R. Waring [59]. В группе БДН отмечалось преобладание носителей «нулевого» генотипа GSTT1, однако в британской популяции ассоциации между гомозиготной делецией гена GSTM1 и развитием БДН не было установлено. В отличие от этого мы в российской популяции обнаружили достоверные различия в распределении генотипа GSTM1(0/0) между больными с БДН и контрольной группой. У больных частота генотипа GSTM1(0/0) была достоверно снижена, а генотипа GSTM1(+) — достоверно повышена (см. табл. 4). Более того, при анализе распределения комбинированных генотипов GSTT1/ GSTM1 обнаружены статистически значимые разли- чия между группами БДН и контроля (р=0,033) ввиду преобладания комбинаций генотипов GSTT1(0/0)/ GSTM1/(0/0) и GSTT1(+)/GSTM1(0/0) в группе контроля и комбинаций генотипов GSTT1(0/0)/ GSTM1(+) и GSTT1(+)/GSTM1(+) в группе БДН.

ОБЩИЕ ВОПРОСЫ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ

Распределение генотипов Ile105Val-полиморфизма гена GSTP1 у больных с разными вариантами БДН.

Темные столбцы — классический вариант, светлые — сегментарноядерный и пирамидный варианты БДН.

корреляция Спирмена: r=0,242, p=0,036). Дальнейший анализ показал, что наличие аллеля дикого типа (GSTP1*A/GSTP1*A) ассоциировано с классическим вариантом БДН (равномерным поражением центральных и периферических мотонейронов), тогда как наличие аллеля GSTP1*В достоверно коррелировало с сегментарно-ядерным и пирамидным вариантами БДН, при которых страдают преимущественно либо периферические, либо центральные мотонейроны соответственно (χ2=6,60; р=0,0102; см. рисунок).

Полиморфизм гeнa NAT2. У больных с БДН и в контрольной группе проводили генотипирование NAT2. Выявили наиболее распространенные «медленные» аллели S1, S2 и S3 (NAT2*5, NAT2*6 и NAT2*7 соответственно) и «быстрый» аллель дикого типа F1 (NAT2*4). Частоты аллелей NAT2 и генотипов NAT2, которые соответствовали уравнению Харди — Вейнберга, приведены в табл. 6.

Количество аллелей S1, S2 и S3 и частоты различных генотипов, проанализированные в отдельности, были достаточно низкими (данные не приведены), поэтому мы объединили аллели в две группы («медленные» — S и «быстрые» — F1) и все генотипы разделили на два комбинированных генотипа (быстрые ацетиляторы и медленные и промежуточные ацетиляторы). Распределение быстрых ацетиляторов, как и медленных и промежуточных, в контрольной группе не отличалось от ранее установленного в популяции европеоидов [15]. Частота медленных и промежуточных ацетиляторов была несколько выше в

группе больных БДН, однако прямое сравнение с применением критерия χ2 не выявило достоверных различий частот комбинаций аллелей и генотипов NAT2 в группах больных и контроля (см. табл. 6). Достоверных корреляций между типами ацетиляторов и клиническими характеристиками БДН не обнаружено.

Обсуждение

Цель настоящего исследования заключалась в оценке возможного участия полиморфизмов отдельных генов системы детоксикации и их комбинаций в патогенезе БДН. Молекулярно-генетический анализ семейной формы БДН показал, что в патогенезе заболевания участвует несколько генов. Однако мутации в этих генах объясняют лишь 10% случаев семейной и спорадической БДН. В большинстве случаев БДН ее первичные причины не установлены. Это обусловливает необходимость выявления других генов, участвующих в патогенезе БДН. Эти гены могут запускать развитие нейродегенерации или же служить факторами предрасположенности к ее развитию в со- четании с другими генетическими факторами или факторами окружающей среды, такими как действие ксенобиотиков. Одним из значимых патогенетических факторов БДН являются свободные радикалы [35]. Это дает основание полагать, что в патогенезе БДН могут участвовать процессы детоксикации. Гены, кодирующие ферменты, которые метаболизируют ксенобиотики, характеризуются значительным полиморфизмом, и наличие делеций или «медленных» аллелей может приводить к дисбалансу процессов детоксикации. CYP, GSTs и NAT2 играют важную роль в развитии многих заболеваний и метаболизме ксенобиотиков.

Важную роль в защите организма от действия ксенобиотиков играют CYP [21]. Ранее было показано, что CYP2E1 и CYP2D6 могут участвовать в патогенезе неврологических заболеваний [11, 17, 51, 56]. CYP2E1 (этанолиндуцибельный фермент) характеризуется инсерционным полиморфизмом 96 п.о. (CYP2E1*1D), наличие которого ассоциировано с более высокой индуцированной активностью по сравнению с диким типом [38]. Ассоциация между полиморфизмом CYP2E1*1D и развитием БДН ранее не изучалась. В настоящем исследовании показано, что частота аллеля CYP2E1*1D значительно повышена у больных БДН (14% при 2,5% в контроле; р<0,001). Обнаруже-

на также достоверно более высокая частота гомозиготных носителей аллеля CYP2E1*1D и комбинированного генотипа CYP2E1 (CYP2E1*1D гетерозиготы

èCYP2E1*1D гомозиготы) среди больных с БДН в российской популяции. Эти данные говорят о нали- чии ассоциации между полиморфизмом CYP2E1*1D

èразвитием спорадической БДН, а также об участии аллеля CYP2E1*1D в патогенезе спорадической БДН в российской популяции больных. CYP2E1 — это белок, продуцирующий свободные радикалы [66]. Он обладает способностью индуцировать катализируемую ионом железа реакцию Фентона и усиливать опосредованный гидроксил-радикалами метаболизм некоторых ксенобиотиков, особенно этанола [16]. Индукция этого фермента в астроцитах приводила к развитию оксидантного стресса, увеличивала продукцию метаболитов перекисного окисления липидов и снижала концентрацию глутатиона [41]. Эти процессы могут участвовать в дегенерации мотонейронов. Мы также установили, что наличие аллеля CYP2E1*1D достоверно коррелирует с развитием наиболее злока- чественных форм БДН, таких как грудной и диффузный дебюты БАС и ПБП. Показано, что при одной и той же мутации гена Cu-, Zn-зависимой супероксиддисмутазы (СОД-1) в рамках одной семьи смогут развиваться разные фенотипы БДН [20]. Продукты модифицирующих генов или факторов предрасположенности могут отчасти способствовать такой фенотипической вариабельности. Этот феномен может объяснять выявленные нами корреляции между вариантами генотипа CYP2E1*1D и клиническими характеристиками БДН.

Другим цитохромом, который может участвовать в патогенезе БДН, является CYP2D6. Снижение его активности наследуется по аутосомно-рецессивному типу, и носителей данного аллеля относят к группе ММ — «медленной метаболизации» [29]. Аллель CYP2D6*4 ассоциирован со снижением активности CYP2D6 [53]. Анализ этого полиморфизма показал, что гомозиготные носители аллеля CYP2D6*4 достоверно чаще встречаются среди больных с БДН. В другом исследовании ассоциаций с развитием БДН ус-

тановлено достоверное преобладание частоты аллеля CYP2D6*4 при БДН [56]. Замена G→A на границе 3-го интрона и 4-го экзона гена, которая и лежит в основе данного аллельного варианта [22], нарушает сплайсинг РНК, что в свою очередь приводит к преждевременному завершению трансляции и к образованию дефектного продукта, лишенного ферментативной активности. Указанный патологический продукт данного гена может обладать новыми свойствами, прямо или косвенно способствующими дегенерации мотонейронов. Это говорит о том, что наличие аллеля CYP2D6*4 может быть фактором риска развития БДН в российской популяции.

Метаболиты фазы I детоксикации часто токсич- нее первичных соединений, и важно, чтобы они не накапливались. Ферменты фазы II, такие как GST и NAT, преобразуют соединения, синтезированные в фазу I в нетоксичные продукты [48]. Ферменты GST предотвращают развитие оксидантного стресса, инактивируя токсичные соединения и свободные радикалы посредством конъюгации с глутатионом. Делеци-

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 1, 2006

ГЕНЕТИКА БОЛЕЗНИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕЙРОНА

онные варианты генов GSTT1 и GSTM1, а также Ilе105Val-полиморфизм гена GSTP1 в его 5-м экзоне служат предрасполагающими факторами к развитию различных заболеваний, в частности хронического бронхита, атеросклероза, разных видов рака [26] и неврологических заболеваний [59]. Поскольку токсины окружающей среды и оксидантный стресс принимают участие в патогенезе неврологических заболеваний, снижение протективных свойств глутатион- S-трансфераз при наличии «нулевых» вариантов изоформ GSTT1 и GSTM1, а также валинсодержащей изоформы GSTP1 может быть ассоциировано с развитием БДН. Анализ распределения генотипов в контрольной группе российской популяции соответствует ранее опубликованным зарубежным данным. Анализ Ile105Val-полиморфизма гена GSTP1 не обнаружил различия в распределении генотипов GSTP1 между группами БДН и контроля. Однако нами установлено, что генотип, содержащий аллель дикого типа (изолейцин в 105-м кодоне), ассоциирован с класси- ческим вариантом БДН (равномерным поражением центральных и периферических мотонейронов), тогда как наличие в этом кодоне валина ассоциировано с наличием сегментарно-ядерного и пирамидного вариантов заболевания. Ферменты, кодируемые аллелями 105Val, характеризуются термолабильностью и снижением специфической активности [24, 65], а больные с аллелем 105Val страдают менее злокачественными вариантами поражения мотонейронов. Поэтому возможно, что ген GSTP1 способен оказывать модифицирующее влияние на фенотип БДН в российской популяции.

Проведенный нами анализ распределения генотипов GSTT1 и GSTM1 показал, что частота генотипа GSTM1(0/0) достоверно снижена, а генотипа GSTM1(+) достоверно повышена у больных с БДН. Помимо делеционного аллеля, существуют еще два распространенных аллеля — GSTM1*А и GSTM1*В, в структуре которых имеются замены пар оснований. Предполагается, что гомо- и гетерозиготы по аллелям GSTM1*А и GSTM1*В подвержены различным заболеваниям в меньшей степени по сравнению с носителями генотипа GSTM1(0/0) [19, 23], а гетерозиготный генотип АВ может оказывать протективное влияние в отношении БДН по аналогии с протективным эффектом в отношении рака прямой кишки и опухолей головного мозга, который характерен для данных генотипов [19]. Достоверное снижение частоты генотипа GSTM1(0/0) у обследованных нами больных может быть вызвано сцеплением аллеля GSTM1(0) с протективными аллелями GSTM1*А и GSTM1*В или гетерозиготными генотипами. Методика ПЦР, примененная в настоящем исследовании, не позволяла различить аллели GSTM1*А и GSTM1*В, однако использование другого метода на большем количестве больных в будущем может помочь в решении этой проблемы.

Другим важным участником фазы II является ариламин-N-ацетилтрансфераза 2-то типа (NAT2), которая катализирует N-ацетилирование большого числа ксенобиотиков. Многие работы свидетельствуют о влиянии полиморфизма ацетилирования NAT2 на развитие различных заболеваний, в том числе некото-

11

рых видов рака [4, 28, 34] и неврологических, например болезни Паркинсона [7]. В одном из исследований [43] cообщается о повышении частоты полиморфизма «медленных ацетиляторов» в группе БДН по сравнению с контрольной группой в Великобритании, однако эта закономерность не была подтверждена после введения поправки на множественные сравнения. Полученные нами результаты подтверждают эти данные. Мы установили, что в частоте комбинаций аллелей и генотипов NAT2 не имеется достоверных различий между группами БДН и контроля. Это позволяет предположить, что полиморфизм ацетилирования NAT2 не участвует в патогенезе БДН у обследованных нами больных.

В заключение считаем возможным высказать предположение, что в развитии спорадической БДН у больных из Российской Федерации участвуют по крайней мере 4 гена I и II фаз детоксикации — СYР2E1,

CYP2D6, GSTP1 è GSTM1.

Исследование отчасти поддержано грантом Российского фонда фундаментальных исследований (гранты ¹ 04-04-49510, 04-04-08117), программой Российской Академии Наук «Физико-химическая биология», грантом Президента Российской Федерации в поддержку молодых ученых России (грант МК-3047.2004.4) и грантом Президента Российской Федерации в поддержку ведущих научных школ (грант ScS-1430.2003.4).

1.Жеребцова А.Л., Шадрина М.И., Левицкий Г.Н. и др. Анализ Ilel05Val полиморфизма гена глутатион-S-трансферазы при спорадиче- ской болезни двигательного нейрона в Российской Федерации. Генетика 2004; 6: 69.

2.Cкворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А. и др. Особенности спорадической болезни двигательного нейрона, ассоциированной с мутациями D90A и G12R, в российской популяции. Журн неврол и психиат 2003; 103: 46—52.

3.Abdel-Rahman S.Z.,el-Zein R.A., Anwar W.A.,Au W.W.A multiplex PCR procedure for polymorphic analysis of GSTM1 and GSTT1 genes in population studies. Cancer Lett 1996; 107: 229—233.

4.Ambrosone C.B., Freudencheim J.L., Graham S. et al. Cigarette smoking, N-acetyltransferase 2 genetic polymorphisms, and breast cancer risk. J Am Med Assoc 1996; 276: 1494—1512.

5.Andersen P.M. Genetics of sporadic ALS. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 2001; 2: 37—41.

6.Andersen P.M., Sims K.B., Xin W.W. et al. Sixteen novel mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase gene in amyotrophic lateral sclerosis: a decade of discoveries, defects and disputes. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 2003; 4: 62—73.

7.Bandmann O., Vaughan J.R., Holmans P. et al. Detailed genotyping demonstrates association between the slow acetylator genotype for N-acetyltransferase 2 (NAT2) and familial Parkinson’s disease. Mov Disord 2000; 15: 30—35.

8.Baranova H., Canis M., Ivaschenko T. et al. Possible involvement of arylamine N-acetyltransferase 2, glutathione S-transferases Ml and Tl genes in the development of endometriosis. Mol Hum Reprod 1999; 5: 636—641.

9.Bertz R.J., Granneman G.R. Use of in vitro and in vivo data to estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. Clin Pharmacokinet 1997; 32: 210—258.

10.Bikmaeva A.R., Sibiriak S.V., Khusnutdinova E.K. Insertional polymorphism of the CYP2E1 gene in infiltrative pulmonary tuberculosis in populations of Bashkortostan Republic. Mol Biol 2004; 38: 239—243.

11.Borroni Â., Archetti S., Agosti C. et al. Intronic CYP46 polymorphism along with ApoE genotype in sporadic Alzheimer Disease: from risk factors to disease modulators. Neurobiol Aging 2004; 25: 747—751.

12.Brown M.A., Edwards S., Hoyle E. et al. Polymorphisms of the CYP2D6 gene increase susceptibility to ankylosing spondylitis. Hum Mol Genet 2000; 9: 1563—1566.

13.Cacabelos R. The application of functional genomics to Alzheimer’s disease. Pharmacogenomics 2003; 4: 597—621.

14.Cascorbi I., Drakoulis N., Brockmoller J. et al. Arylamine N-acetyl- transferase (NAT2) mutations and their allelic linkage in unrelated Caucasian individuals: correlation with phenotypic activity. Am J Hum Genet 1995; 57: 581—592.

16.Dupont I., Lucas D., Clot P. et al. Cytochrome P4502E1 inducibility and hydroxyethyl radical formation among alcoholics. J Hepatol 1998;

28:564—571.

17.Forsyth J.T., Grünewald R.A., Rostami-Hodjegan A. et al. Parkinson’s disease and CYP1A2 activity. Br J Clin Pharmacol 2000; 50: 303— 309.

18.Fritsche E., Pittman G., Bell D.A. Localization, sequence analysis, and ethnic distribution of a 96-br insertion in the promoter of the human CYP2E1 gene. Mutation Research Genomics 2000; 432: 1—5.

19.Fryer A.A., Zhao L., Alldersea J. et al. Use of site-directed mutagenesis of allele-specific PCR primers to identify the GSTM1A, GSTM1B, GSTM1 A,B and GSTM1 null polymorphisms at the glutathione S-transferase, GSTM1 locus. Biochem J 1993; 295: 313— 315.

20.Giess R., Holtmann B., Braga M. et al. Early onset of severe familial amyotrophic lateral sclerosis with a SOD-1 mutation: potential impact of CNTF as a candidate modifier gene. Am J Hum Genet 2002;

70:1277—1286.

21.Gonzalez F.J. The molecular biology of cytochrome P450s. Pharmacol Rev 1988; 40: 243—288.

22.Gough A.C., Miles J.S., Spurr N.K. et al. Identification of the primary gene defect at the cytochrome P450 CYP2D locus. Nature 1990;

347:773—776.

23.Harada S., Misawa S., Nakamura T.„et al. Detection of GSTI gene deletion by the polymerase chain reaction and its possible correlation with stomach cancer in Japanese. Hum Genet 1992; 90: 62—64.

24.Harries L.W., Stubbins M.J., Forman D. et al. Identification of genetic polymorphisms at the glutathione S-transferase Pi locus and association with susceptibility to bladder, testicular and prostate cancer. Carcinogenesis 1997; 18: 641—644.

25.Harris M.J., Coggan M., Langton L. et al. Polymorphism of the Pi class glutathione S-transferase in normal populations and cancer patients. Pharmacogenetics 1998; 8: 27—31.

26.Hatagima A. Genetic polymorphisms and metabolism of endocrine disruptors in cancer susceptibility. Cad Saude Publica 2002; 18: 357— 377.

27.Hein D.W., Doll M.A., Rustan T.D. et al. Metabolic activation and deactivation of arylamine carcinogens by recombinant human NAT1 and polymorphic NAT2 acetyltransferases. Carcinogenesis 1993; 14: 675—678.

28.Hung R.J., Boffetta P., Brennan P. et al. GST, NAT, SULT1A1, CYP1B1 genetic polymorphisms, interactions with environmental exposures and bladder cancer risk in a high-risk population. Int J Cancer 2004; 10: 598—604.

29.Ingelman-Sundberg M., Oscarson M., McLellan R.A. Polymorphic human cytochrome P450 enzymes: an opportunity for individualized drug treatment. Trends Pharmacol Sci 1999; 20: 342—349.

morphisms in xenobiotic metabolism as a predictor of disease susceptibility. Environ Health Perspect 1994; 102: 55—61.

ylase gene polymorphism in motor neuron disease. Neurodegeneration 1994; 3: 149—152.

31.Landi S. Mammalian class theta GST and differential susceptibility to carcinogens: a review. Mutat Res 2000; 463: 247—283.

32.Leigh P.N., Ray-Chaudhuri K. Motor neuron disease. J Neurol Neurosurg Psychiat 1994; 57: 886—896.

33.Lieber C.S. Cytochrome P4502E1: its physiological and pathological role. Physiol Rev 1997; 77: 517—544.

34.Lincz L.F., Kerridge I., Scorgie F.E. et al. Xenobiotic gene polymorphisms and susceptibility to multiple myeloma.Haematologica2004;

89:628—629.

35.Liu D., Wen J., Liu J., Li L. The roles of free radicals in amyotrophic lateral sclerosis: reactive oxygen species and elevated oxidation of protein, DNA, and membrane phospholipids. FASEB J 1999; 13: 2318—2328.

36.Majoor-Krakaauer D., Willems P.J., Hofman A. Genetic epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis. Clin Genet 2003; 63: 83—101.

37.Mannervik Â. The isoenzymes of glutathione transferase. In: Advances in Enzymology. Ed. A. Meister. New York: Wiley and Sons 1985;

57:357—417.

38.McCarver D.J., Byun R., Hines R.N. et al. A genetic polymorphism in the regulatory sequences of human CYP2E1: association with increased chlorzoxazone hydroxylation in the presence of obesity and ethanol intake. Toxicol Appl Pharmacol 1998; 152: 276—281.

39.McCarver D.G. ADH2 and CYP2E1 genetic polymorphisms: risk factors for alcohol-related birth defects. Drug Metab Dispos 2001; 29: 562—565.

40.Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A sample salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 1988; 16: 1215.

41.Montoliu Ñ., Sancho-Tello M., Azorin I. et al. Ethanol increases cytochrome P4502E1 and induces oxidative stress in astrocytes. J Neurochem 1995; 65: 2561—2570.

42.Nelson L.M. Epidemiology of ALS. Clin Neurosci 1996; 3: 327—331.

43.Nicholl D.J., Bennett P., Hiller L. et al. A study of five candidate genes in Parkinson’s disease and related neurodegenerative disorders. European Study Group on Atypical Parkinsonism. Neurology 1999;

53:1415—1421.

44.Noor R., Mittal S., Iqbal J. Supperoxide dismutase — applications and relevance to human diseases. Med Sci Monit 2002; 8: 210—215.

45.Norris F.H., Callachini P.R., Fallat R.G. et al. Administration of guanidine in amyotrophic lateral sclerosis. Neurology 1974; 24: 721— 728.

46.Norris F., Shepherd R., Denys E. et al. Onset, natural history and outcome in idiopathic adult motor neuron disease. J Neurol Sci 1993; 118: 48—55.

47.Pickett C.B., Lu A.Y. Glutathione S-transferases: gene structure, regulation, and biological function. Annu Rev Biochem 1989; 58: 743— 764.

48.Raunio H., Husgafvel-Pursiainen K., Anttila S. et al. Diagnosis of polymorphisms in carcinogen-activating and inactivating enzymes and cancer susceptibility. Gene 1995; 159: 113—121.

49.Raymond M.L., Rousset F. An exact test for population differentiation. Evolution 1995; 49: 1280—1283.

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 1, 2006

ГЕНЕТИКА БОЛЕЗНИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕЙРОНА

50.Rebbeck T.R. Molecular epidemiology of the human glutathione S- transferase genotypes GSTM1 and GSTT1 in cancer susceptibility. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1997; 6: 733—743.

51.Riedl A.G., Watts P.M., Jenner P. et al. P450 enzymes and Parkinson’s disease: the story so far. Mov Disord 1998; 13: 212—220.

52.Saarikoski S.T., Voho A., Reinikainen M. et al. Combined effect of polymorphic GST genes on individual susceptibility to lung cancer. Int J Cancer 1998; 77: 516—521.

53.Sachse Ñ., Brockmoller J., Bauer S., Roots I. Cytochrome P450 2D6 variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic consequences. Am J Hum Genet 1997; 60: 284—295.

54.Santt O., Baranova H., Albuisson E. et al. Interaction between GSTMlnull and CYP2D6-deficient alleles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Eur J Neurol 2004; 11: 247—251.

55.Seidegard J., Vorachek W.R., Pero R.W., Pearson W.R. Hereditary differences in the expression of the human glutathione transferase active on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 7293—7297.

56.Siddons M.A., Pickering-Brown S.M., Mann D.M.„et al. Debrisoquine hydroxylase gene polymorphism frequencies in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett 1996; 208: 65—68.

57.Spielberg S.P. N-acetyltransferases: pharmacogenetics and clinical consequences of polymorphic drug metabolism. J Pharmacokinet Biopharm 1996; 24: 509—519.

58.Steventon G.B., Heafield M.T., Waring R.H., Williams AC. Xenobiotic metabolism in Parkinson’s disease. Neurology 1989; 39: 883—887.

59.Stroombergen M.C., Waring R.H. Determination of glutathione S- transferase mu and theta polymorphisms in neurological disease. Hum Exp Toxicol 1999; 18: 141—145.

60.Spurr N.K., Gough A.C., Chinegwundoh F.I., Smith C.A. Polymorphisms in drug-metabolizing enzymes as modifiers of cancer risk. Clin Chem 1995; 41: 1864—1869.

61.Suzuki Ò., Coggan M., Shaw D.V., Board P.G. Electrophoretic and immunological analysis of human glutathione S-transferase isozymes. Annals of Human Genetics 1987; 51: 95—106.

62.Waring R.H., Steventon G.B., Sturman S.G. et al. S-methylation in motorneuron disease and Parkinson’s disease. Lancet 1989; 2: 356— 357.

63.Watson M.A., Stewart R.K., Smith G.B. et al. Human glutathione S- transferase P1 polymorphisms: relationship to lung tissue enzyme activity and population frequency distribution. Carcinogenesis 1998; 19: 275—280.

64.Wolf C.R., Dale Smith C.A., Gough A.C. et al. Relationship between the debrisoquine hydroxylase polymorphism and cancer susceptibility. Carcinogenesis 1992; 13: 1035—1038.

65.Zima T., Fialova L., Mestek O. et al. Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases. J Biomed Sci 2001; 8: 59—70.

66.Zimniak P., Nanduri Â., Pikula S. et al. Naturally occurring human glutathione S-transferase GSTP1-1 isoforms with isoleucine and valine in position 104 differ in enzymic properties. Eur J Biochem 1994; 224: 893—899.

Поступила 22.09.05

13