Механизмы Серологических Реакци Иммунология
.pdfМинистерство образования и науки Российской Федерации Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
О. П. Комкова, А. М. Образцова, Н. А. Сидорова
МЕХАНИЗМЫ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
Методические указания для студентов медицинского факультета
Петрозаводск 2006
Печатаются по решению редакционно-издательского совета Петрозаводского государственного университета.
Рецензент доктор биологических наук Е. К. Олейник
Комкова, О. П.
Механизмы серологических реакций: Методические ука- зания для студентов медицинского факультета / О.П. Комкова, А. М. Образцова, Н. А. Сидорова; ПетрГУ. − Петрозаводск, 2006. − с.
Методические указания разработаны для лабораторных занятий по практической иммунологии для студентов медицинского факультета. В издании изложены классические серологические методы выявления и ко- личественного определения антигенов и антител, дана характеристика ан- тигена и антитела, описаны принципы методов и их практическое приме- нение.
ПРЕДИСЛОВИЕ
Методические указания по механизмам серологических реакций со- ставлены в соответствии с программой курса иммунологии для студен- тов медицинских специальностей вузов на основе учебной литературы по иммунологии и материалах, излагаемых в лекциях.
Задача настоящих указаний – помочь студентам овладеть методами серологических реакций, углубить и закрепить полученные знания. Пред- ложенный материал рассчитан для студентов курсов, знакомых с осно- вами органической химии, биохимии, молекулярной биологии.
Основная часть материала посвящена классическим серологическим методам выявления и количественного определения антигенов и антител. Описаны принципы, возможности методов и их практическое примене- ние. Это позволит студентам свободно ориентироваться в накопленном экспериментальном материале, правильно подходить к выбору методов исследования и интерпретировать данные в дальнейшей профессиональ- ной деятельности.
Подробное изложение материала поможет студентам самостоя- тельно выполнять предлагаемые задания и правильно оформлять полу- ченные результаты.
3
ВВЕДЕНИЕ
В основе всех реакций иммунитета лежит специфическое взаимодействие антитела (Ат) с антигеном (Аг). Эти реакции называют серологическими, так как для их постановки ис- пользуют сыворотки (serum), содержащие Ат. В серологиче- ских реакциях один компонент (ингредиент) должен быть все- гда известен. Серологические реакции применяются в сле- дующих случаях:
а) для определения неизвестного Аг (бактерия, вирус, токсин и др.) с помощью известного Ат (иммунная сыворотка); б) для определения Ат в сыворотке с помощью известного Аг.
В зависимости от состояния Аг и особенностей среды, в которой взаимодействуют Аг и Ат, различают реакции агглю- тинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа, радио- иммунного анализа и другие.
4
МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНА С АНТИТЕЛОМ
Взаимодействие антигена со специфическим антителом проявляется в организме образованием иммунных комплек- сов. Свойства комплекса АГ – АТ показано на рисунке 1.
Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют: количе- ство детерминант в АГ, количественное соотношение, после- довательность расположения концевых групп аминокислот в детерминанте, наличие в детерминанте ароматических амино-
кислот, аффинность и авидность (рис. 2).
Аффинитет – это связь одного активного центра: Fab 1
или Fab 2 и детерминанты.
Авидность – это cвязь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами.
5
|
|
|
Свойства комплекса АГ – |
АТ |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
обратимая |
|
|
|
|
|
аффинитетом |
|
|
авидностью |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
измеряется |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Взаимосвязь с по- |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
нековалентная |
|
|
верхностными струк- |
|
прочная |
|
||||||||
|
|
|
|
|
|
турами АГ и АТ |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Связь АГ-АТ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Формируется |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
В комплексе не |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
при оптималь- |
||||
|
КОМПЛЕКС АГ-АТ |
|
|
|||||||||||
происходит |
|
|
|
ном соотноше- |
||||||||||
инактивации |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
нии |
||||
АГ и АТ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
АГ и АТ |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
Приобретает новые свойства в отличие от свойств |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
составляющих его компонентов |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Спирохты + АТ→ сорбирует бактерии
Комплекс холерный вибрион +АТ→сорбирует тромбоци-
Растворимый или |
+АТ→ прикрепляется к Fc - |
|
|
|
||
корпускулярный АГ |
рецепторам на макрофагах |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Растворимый или |
+АТ→ присоединяет к |
→ активация |
|
|
||
корпускулярный АГ |
себе комплемент |
комплемента |
|
|
||
|
|
|
|
|||
|
|
|
||||
Растворимый или |
+АТ + компле- → присоединяется к рецепторам |
|
||||
корпускулярный АГ |
мент |
комплемента на макрофагах |
|
|||
|
|
|
||||
|
|
|
||||
Растворимый или |
+АТ→ комплекс средних размеров индуцирует |
|
||||
корпускулярный АГ |
иммунокомплексный тип алергии |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
СХЕМАТИЧЕСКОЕ ИЗОБРАЖЕНИЕ СТЕПЕНИ АФФИНИТЕТА И АВИДНОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕРИЧЕСКОГО СООТВЕТСТВИЯ РЕАГИ- РУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ – АГ и АТ
Связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и де-
терминанты – |
аффинитет. |
|
Связь всех активных цетров: Fab1 и |
Fab2 с детерми- |
|
нантами – авидность. |
|
|
детерминанта |
детерминанта |
детерминанта |
АГ |
авидность |
АГ |
АГ |
|
|
|
|
|
|
|
Неполное |
|
|
Отсутст- |
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
аффинитет |
|
|
|
стерическое |
|
|
вие стери- |
|
|
|
|
|
|
|
соответствие |
|
|
ческого |
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
соответст- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
вия |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
антитело |
антитело |
антитело |
||||||||
высокий |
|
средний |
|
слабый |
||||||
аффинитет и |
аффинитет и |
аффинитет и |
||||||||
авидность |
авидность |
авидность |
||||||||
7
МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АГ И АТ (детерминанты и активного центра)
Электростатические |
Притяжение между двумя проти- |
|
силы |
воположно заряженными ионизи- |
|
|
рованными группами |
|
|
(NH3+ |
и СОО- ) |
Водородные |
Образование слабых водородных |
|
связи |
связей мнжду ОН, NН2 и СООН |
|
|
гидрофильными группами. |
|
Гидрофобные |
При соприкосновении гидрофоб- |
|
взаимодействия |
ных групп белков в воде наступает |
|
|
их взаимное притяжение. |
|
Вандерваальсовы |
Взаимодействие внешних элек- |
|
силы |
тронных облаков, зависящее от |
|
|
площади контакта АГ и АТ и |
|
|
встречи зарядов противоположно- |
|
|
го знака. |
|
Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro» и имеют ряд типичных характеристик: потребность в электро- литах, обратимость, двухфазность (фаза взаимодействия ак- тивного центра АТ и детерминант АГ – несколько секунд или минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект - несколько минут или часов).
8
Часто такие реакции называют серологическими (от латин- ского «serum» – сыворотка), так как источником АТ служит сыворотка крови.
В связи с высокой чувствительностью и специфичностью серологические реакции нашли широкое диагностическое применение.
Серологические реакции применяют для двух целей:
1.По известному АГ определяют в исследуемой сыворотке титр специфических к данному АГ антител. Титром сыворот- ки называют то ее максимальное разведение, которое еще дает положительную реакцию с соответствующим АГ.
2.С помощью известного АТ, т.е. диагностической иммун- ной сыворотки, определяют наличие в исследуемом материале специфического антигена или осуществляют серологическую идентификацию выделенной чистой культуры возбудителя.
Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:
1.Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в рас- творе электролита: реакция агглютинации в ее различ- ных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации.
2.Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их мо- дификации.
3.Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: ре- акции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции тор- можения гемагглютинации.
4.Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсоно- фагоцитарная реакция и другие.
5.Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.
6.Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.
9
АНТИГЕНЫ
Для серологических реакций могут быть использованы це- лые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоци- ты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые клетки и т.д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (рас- творимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других.
Принципы получения корпускулярного антигена: Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивиро-
ванные) клетки в изотонических или буферных растворах. При инактивации клеток пользуются методами, не вызы-
вающими изменения специфичности и снижения иммуноген- ных свойств.
Микроорганизмы инактивируют: 1) высокой температурой, подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации белков; 2) химическими веществами (формалином, спиртом и другими); 3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгенов- скими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опу- холевые клетки.
Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и жи- вотных.
С помощью серологических реакций выявляют у иссле- дуемых бактериальных клеток антигенный состав.
Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в се- рологических реакциях используют для определения локали- зованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД-маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам.
10