Механизмы Серологических Реакци Иммунология
.pdfв) Постановка ориентировочной реакции агглютинации с ти- повыми адсорбированными сальмонеллезными Н- сыворотками. Испытать чистую культуру сальмонелл в пла- стинчатой реакции агглютинации с типовыми Н-сыворотками
вразведении 1:5, содержащей АТ к сальмонеллам, входящим
всерогруппу сальмонелл, с групповой сывороткой которой произошла реакция на предыдущем этапе.
11.Произвести серотипирование выделенной чистой куль- туры Shigella реакцией Ко-агглютинации.
Ингредиенты:
1.Набор КоА реагентов (Ко-А реагент к Sh. Sonne, Ко-А реагент к Sh. Flexneri).
2.Исследуемый материал.
3.Физиологический раствор.
Постановка реакции. На предметное стекло, положенное на лист черной бумаги, наносят капли Ко-А реагентов и кап- лю физиологического раствора (для контроля культуры на спонтанную агглютинацию). Затем вносят титруемую культу- ру во все капли. Покачивая стекло, наблюдают коагглютина- цию. Реакцию учитывают по 3-х плюсовой шкале:
( +++ ) − полная коагглютинация, полное просветление фона,
(++ ) |
− |
хорошо выраженная коагглютинация, явное просвет- |
|
|
ление фона, |
( +) |
− неполная коагглютинация, слабое просветление фона, |
|
(-) |
– |
отсутствие коагглютинации, реакция отрицательная. |
Заключение о принадлежности выделенной культуры де- лают на основании положительной реакции Ко-агглютинации не менее, чем на (++) 2 креста при отсутствии спонтанной агг- лютинации в контроле.
21
111. Произвести серотипирование выделенной чистой культу- ры Shigella с помощью РНГА.
Ингредиенты: 1.Исследуемый материал.
2.Эритроцитарные диагностикумы антительные к Sh. Sonne,
к Sh. Flexneri. 3.Физиологический раствор.
Постановка реакции. В лунки полистиролового планшета вносят дизентерийные эритроцитарные диагностикумы анти- тельные (по 0,25 мл), в одну лунку ( для контроля) добавляют 0,25 мл физиологического раствора, во все лунки вносят взвесь культуры шигелл по 0,25 мл. Встряхивают планшеты и ставят на 2 часа в термостат. Учет проводят по внешнему виду осадка и по прозрачности надосадочной жидкости.
Вотрицательной реакции эритроциты оседают на дно в ви- де плотного диска с ровными краями («пуговка»), в положи- тельной – осадок имеет вид кружев («зонтик»).
Вслучае титрования антигена из антигенсодержащего ма- териала готовят серию двукратных разведений в объеме 0,25 мл и к ним доливают по 0,25 мл антительного эритроцитар- ного диагностикума.
Учет такой же, как и в предыдущем варианте.
Титр – последнее разведение, где реакция идет на 2 креста
1V. Выявить в сыворотке крови специфические агглюти- нины к бруцеллам развернутой реакцией агглютинации Рой- та.
Ингредиенты: 1.Исследуемая сыворотка. 2.Физиологический раствор.
3.Единый бруцеллезный диагностикум.
22
Постановка реакции. Приготовить основное разведение (1:50) исследуемой сыворотки: внести в пробирку 0,2 мл неразве- денной сыворотки, добавить к ней 9,8 мл раствора хлорида натрия и тщательно перемешать. Из основного разведения сы- воротки сделать ряд последовательных, кратных двум разве- дений от 1:100 до 1:1600 в агглютинационных пробирках, ус- тановленных в штатив.
Затем прибавить по 3 капли бруцеллезного диагностикума. Поставить контроли: контроль сыворотки (1 мл сыворотки в разведении 1:50 ) и контроль диагностикума (3 капли диагно- стикума и 1 мл физ. раствора). Штатив с пробирками встрях- нуть и поместить в термостат при 37 о С на 18-20 часов.
Таблица
Схема постановки опыта
|
|
|
|
|
|
Контроль |
Контроль |
Ингредиенты |
|
Доза реагентов, мл |
|
АТ |
АГ |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
Физ.раствор |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
- |
1 |
Сыворотка |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
- |
исследуемая |
|
|
|
|
|
|
|
АТ (1:50) |
|
|
|
|
|
|
|
Полученное |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:1600 |
|
|
разведение |
|
|
|
|
|
|
|
Бруцеллезный |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
- |
3 |
диагностикум |
|
|
|
|
|
|
|
(капли) |
|
|
|
|
|
|
|
Результаты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
23 |
Провести учет основываясь на величине осадка и степени просветления жидкости. Контроль сыворотки должен быть прозрачным. Контроль АГ – равномерно мутным. Если кон- троли хорошие, устанавить наличие и степень агглютинации во всех опытных пробирках, которую обозначают плюсами:
(++++) – большой осадок и полное просветление, (+++) – большой осадок и неполное просветление жидкости,
(++)– заметный осадок и заметное просветление жидкости,
(+) – очень слабый осадок и слабое просветление жидкости, (-) – отрицательная реакция, раствор мутный.
Сделать выводы по реакции, учитывая что диагностиче- ский титр при бруцеллезе 1:200.
V. Выявить в сыворотке крови антитела к шигеллам в реак- ции пассивной гемагглютинации.
Ингредиенты: 1.Исследуемая сыворотка.
2.Эритроцитарный диагностикум Sh. Sonne.
3.Эритроцитарный диагностикум Sh. Flexneri.
4.Физиологический раствор.
Постановка реакции. Приготовить основное разведение (1:50) исследуемой сыворотки, смешивая в пробирке 0,2 мл сыво- ротки и 0,8 мл физиологического раствора.
В 2-х рядах лунок полистиролового планшета последова- тельно развести в физиологическом растворе исследуемую сыворотку в объеме 0,5 мл от 1:100 до 1:6400. Во все лунки первого ряда внести по 0,25 мл эритроцитарного диагности- кума Sh. Sоnne, второго ряда по 0,25 мл эритроцитарного ди- агностикума Sh. Flexneri.
24
Для проверки спонтанной агглютинации диагностикумов в лунки внести по 0,25 мл диагностикумов и 0,5 мл физиологи- ческого раствора. Встряхнуть планшеты и поместить в термо- стат при 37 о С на 2-3 часа.
Учесть реакцию по внешнему виду осадка эритроцитов и прозрачности надосадочной жидкости.
Таблица
Схема постановки опыта по РСК
Ингредиенты |
|
Доза реагентов |
( мл ) |
|
Контроль |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Физиологический |
|
|
|
|
|
|
|
|
раствор |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0.5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Сыворотка исследуемая |
|
|
|
|
|
|
|
|
в разведении 1:50 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Полученное разведение |
|
|
|
|
|
|
|
- |
|
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:1600 |
1:3200 |
|
|
|
1:6400 |
|
|
|
|
|
|
|
Эритроцитарный диаг- |
|
|
|
|
|
|
|
|
ностикум из шигелл |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
25
2. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ - это агрегация антите-
лами (преципитинами) растворимых (молекул) АГ (преци- питиногенов), проявляющаяся в помутнении прозрачной жид- кости, в появлении преципитата в виде осадка, кольца и т.д. Таким образом, в отличие от реакции агглютинации, антиген для реакции преципитации обязательно должен быть в моле- кулярном виде.
Механизм реакции преципитации аналогичен реакции агг- лютинации, т.е. по «теории решетки».
Осаждение из раствора комплексов АГ - АТ происходит в диапазоне эквивалентных соотношений концентраций взаи- модействующих молекул. В случае большого избытка одного из реагентов образуется растворимый комплекс АГ-АТ и фе- номен реакции не проявляется.
Поскольку преципитиноген имеет ультрамикроскопическое строение и его концентрация в единице объема выше, чем АТ в таком же объеме сыворотки, то для осаждения более легких частичек АГ с образованием видимого преципитата необхо- димо значительно большее количество АТ. Поэтому диагно- стические преципитирующие сыворотки выпускают с высо- ким титром АТ.
Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и твер- дой среде.
26
Реакция преципитации в жидкой среде
Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании рас- творов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципи- тата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреци-
питации.
Реакция преципитации в агаре ( геле )
Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно освет- ленный гель из агар-агара.
Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии пре- ципитата.
Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.
Двойная иммунодиффузия по Оухтерлони.
Вагаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на пред- метное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями.
Влунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий. Поскольку диффузия реагентов из лунок
вгель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами раз- ных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в
27
центральную лунку внести известный АГ, а в перифериче- ские – исследуемую сыворотку в разных разведениях.
Метод двойной иммунодиффузии применяют преимуще- ственно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.
Для количественного определения антигена часто исполь-
зуют простую радиальную иммунодиффузию по Манчини,
которая основана на измерении диаметра кольца преципита- ции, образующегося при внесении раствора исследуемого АГ в лунки, вырезанные в слое геля, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка.
В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципита- ции прямо пропорционален концентрации исследуемого АГ.
Содержание АГ определяют относительно стандартного раствора АГ с известной его концентрацией. Чаще всего при помощи этого метода определяют белковые АГ: количество Yg разных классов в сыворотке крови и других жидкостях, секретов желез, белков крови, спинномозговой жидкости и т.д.
Реакцию иммунодиффузии обычно поводят при комнатной температуре, во влажных камерах. Продолжительность имму- нодиффузии зависит от природы АГ.
Методы иммунодиффузии обладают высокой специфично- стью и чувствительностью.
Практическое применение реакции преципитации.
РП применяются:
-для изучения АГ структуры бактерий, сложных белков, жидкостей человека и
животных;
-для изучения токсигенности бактерий;
-при диагностике ряда инфекционных заболеваний бактери- альной, вирусной,
грибковой природы (сибирской язвы, чумы, туляремии и т.д.);
В качестве АГ используют раневые экссудаты, фильтраты экстрактов пораженных органов, спинно-мозговую жид- кость и т.д.
-для установления степени родства видов микроорганизмов, растений, животных –
определяют общий АГ;
-в судебно-медицинской практике – для определения видо- вой принадлежности
белков (крови, слюны, спермы и т.д.);
-для выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изде- лиях.
ФЛОККУЛЯЦИЯ – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реак- цию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл. Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГ и АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количе- ство сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт
стандартных препаратов.
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ. Вначале проводят электрофо- ретическое разделение АГ в забуференном агаровом геле. После разделения в канавку, которая идет в направлении ми- грации антигенных веществ, вносят преципитирующую им- мунную сыворотку. АГ и АТ диффундируют в геле навстречу друг другу и в месте их взаимодействия образуется дуга пре- ципитации. Дуга – потому что АГ диффундирует из точечно- го источника радиально, а АТ из канавки – ровным фронтом. Это встречный иммуноэлектрофорез.
СХЕМА:
На основе сочетания электрофореза с иммунопреципитацией разработано несколько удачных методов, в каждом из кото- рых перемещение АГ в электрическом поле приводит к его контакту с АТ.
Непрямая преципитация иммунных комплексов.
По целому ряду причин в результате реакции АТ с АГ могут образовываться растворимые комплексы.
Важное значение имеет определение циркулирующих иммун- ных комплексов (ЦИК) при некоторых патологических со- стояниях макроорганизма.
Часто для осаждения ЦИК используют раствор полиэти- ленгликоля (ПЭГ). Есть несколько методик осаждения ПЭГ. Например, можно определить концентрацию ЦИК измерени- ем убыли белка в надосадочной жидкости после осаждения 2% раствором ПЭГ.
Методика:
1)В исследуемой сыворотке определить концентрацию белка биуретовым методом.
2)В пробирки внести 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл 4% раствора ПЭГ (М=6000) на физрастворе (рН 7,2 ). 2% раствор ПЭГ (конечная концентрация) не осаждает белки в сыворотке здоровых яиц, а только иммунные комплексы, в том числе
ирастворимые. В контрольную пробирку вносят 0,6 мл физраствора и 0,5 мл сыворотки. Пробирки закрыть и оста- вить на 18 часов при комнатной температуре
3)После инкубации пробирки центрифугировать 45 минут при 6000 об/мин.
4)В сухие пробирки внести по 0,1 мл надосадочной жидкости
и4,9 мл физраствора. Определить концентрацию белка в опыте и контроле относительно физраствора, содержащего ПЭГ ( 0,5 мл физраствора и 0,5 мл 4% раствора ПЭГ). По