Механизмы Серологических Реакци Иммунология

снижению количества белка в опыте вычисляют количест- во осажденного белка, т.е. количество ЦИК.

Наличие ЦИК не всегда указывает на их патологическое значение. Присутствие ЦИК сопровождает нормальную иммунную реакцию.

Уровень ЦИК возрастает при аутоиммунных заболеваниях (системной красной волчанке, ревматоидном артрите и др.)

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ

1. Определить количество Yg M в испытуемых сыворотках. Ингредиенты: гель, стекла, моноспецифитческие сыворот- ки против YgМ человека,

исследуемые сыворотки, веронал- мединаловый буфер.

При 56 0 С 3% гель смешивают в соотношении 1:1 с ан- тисывороткой, разведенной на веронал-мединаловом бу- фере. Этой смесью покрывают равномерным слоем стекла (9 мл смеси на стекло размером 9х12 см).

Взастывшем геле с антисывороткой пробойником выре- зают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. На стекле делают несколько рядов лунок.

Влунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2 мкл стандартной сыворотки (т.е. с известным количест- вом YgМ), неразведенной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8.

Лунки следующих рядов заполняются испытуемыми сы- воротками. Пластины инкубируют во влажной камере при комнатной температуре в течении 48 часов ( с антисыво- роткой Yg G – 24 часа). По окончании инкубации изме- ряют диаметры колец преципитации.

По стандартной сыворотке строят на миллимитровой бу- маге калибровочную кривую: по оси абсцисс откладывают диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат

– известное количество Yg в мг/ мл, содержащееся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образовавшиеся точки соединяют прямой. Для определе- ния уровня Yg в испытуемой сыворотке поступают сле- дующим образом. На оси абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации испытуемой сыворотки. Восстанав- ливают перпендикуляр до пересечения с кривой, и точку пересечения прооектируют на ось ординат.

Аналогично можно определить количество других классов Yg, фракций комплемента, С-реактивного белка и других белков в сыворотке крови.

2. Для диагностики раневой анаэробной инфекции определить в фильтрате раневого

экссудата наличие АГ соответствующего возбудителя ре- акцией двойной

иммунодиффузии по Оухтерлони.

Ингредиенты: исследуемый фильтрат раневой жидкости, моноспецифические

cыворотки Cl. perfringens, Cl. novi, Cl. Septicum, гель, стекла.

На стекла нанести гель ( 56% ) равномерным слоем. После застывания в нем сделать пробойником ряд лунок: одна лунка

вцентре и четыре по периферии на расстоянии 7 – 8 мм.

Вцентральную лунку микрошприцем внести 2 мкл иссле- дуемого фильтрата, а в периферические лунки внести моно- специфические сыворотки, в четвертую для контроля физрас- твор.

Выдержать во влажной камере 48 часов при комнатной температуре. Учесть по появлению белой преципитационной линии между центральной и периферическими лунками

Постановка и учет РСК

Перед постановкой реакции готовят рабочие растворы реа- гентов РСК.

Антитела (Ig M, Ig G), участвующие в РСК, характеризу- ются способностью связывать комплемент. Исследуемую сы- воротку накануне постановки реакции прогревают на водяной бане при температуре 56о С в течение 30 мин для инактивации собственного комплемента. В день постановки реакции сыво- ротку разводят раствором хлорида натрия (0, 15 моль/л) в со- отношении 1 : 5 (для качественного анализа) или же готовят ряд последовательных, кратных двум разведений – от 1 : 5 до 1 : 640 (для определения титра АТ).

Антигены, используемые в РСК, могут быть корпускуляр- ными или растворимыми: взвеси бактериальных клеток, их лизаты. Белковые или полисахаридные вещества, экстракты из нормальных и патологически изменённых тканей.

Комплементом является смесь сывороток морских свинок

– свежая или лиофилизированная (сухой комплемент – препа- рат промышленного изготовления), которую разводят раство- ром хлорида натрия в соотношении 1 : 10 непосредственно перед употреблением, так как при хранении в жидком состоя- нии её активность снижается.

Гемолитическую сыворотку с известным титром АТ (1 : 1200, 1 : 1600, 1 : 1800) изготовляют промышленным путём, иммунизируя кроликов эритроцитами барана.

Эритроциты получают из дефибринированной крови ба- рана. Кровь фильтруют через трёхслойный марлевый фильтр для удаления плёнок фибрина, затем фильтрат центрифуги- руют (2000 мин-1) в течение 10 мин. Удаляют плазму, а эрит- роциты наоборот остаются.

39

Поэтому антигены перед проведением опыта титруют в присутствии рабочей дозы комплемента.

а) антиген разводят в объёмах 0,5 мл; б) добавляют в каждую пробирку 0, 5 мл рабочей дозы ком- племента;

в) помещают в термостат при температуре 37о С на 1 час; г) добавляют во все пробирки по 1, 0 мл гемолитической сис- темы; д) помещают в термостат при температуре 37о С на 1 час;

За д а н и е: по готовому ряду определить титр антигена (наи- меньшее разведение при котором наблюдается полный гемо- лиз). Рассчитать рабочую дозу антигена (1/2 – 2/3 титра).

4.Постановка основного опыта

За д а н и е: В исследуемой сыворотке выявить титр антител к токсоплазменному антигену.

Ингредиенты:

1. исследуемая инактивированная сыворотка 1 : 5;

2. положительная инактивированная сыворотка 1 : 5;

3. отрицательная инактивированная сыворотка 1 : 5;

4. токсоплазменный антиген для РСК в рабочей дозе;

5. комплемент в рабочей дозе;

6. 3% взвесь бараньих эритроцитов;

7. гемолитическая сыворотка в рабочей дозе;

8. буфер (физиологический раствор) Общие объём ингредиентов реакции 2, 5 мл.

Приготовить в пробирке необходимый объём гемолитиче- ской системы и собрать основную систему по схеме.

41

Серологические реакции с метками высокочувствительны, позволяют быстро получить результат и находят широкое применение для экспресс−диагностики вирусных, бактери- альных и других инфекций, для оценки иммунного статуса человека, в онкологии и т.д.

VII. I. Реакции иммунофлюоресценции

Иммунофлюоресценция – это метод, основанный на ис- пользовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флюоресцентной микроскопии. Он может быть как прямым, так и непрямым (рис. 11).

Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится (конъюгируется) флюоресцирующим красителем. Чаще всего для этого используют флюоресцеинизотиоциона- ты (ФИТЦ) – зеленое свечение в ультрафиолетовом свете и тетраметилродаминизотионат (ТРИТЦ) – оранжево-красное свечение.

АТ, которые метят флюорохромом, должны обладать фи- зико-химической гомогенностью. Наиболее подходящими для мечения являются моноклональные антитела.

АГ (искомым или известным) для РИФ могут быть антиге- ны, локализованные в клетке или на клетке, срезах тканей.

РИФ выявляют и идентифицируют: 1) микроорганизмы в чистых и смешанных культурах, в мазках- отпечатках; 2) клетки, пораженные вирусами и другими микроорганизмами; 3) Т и В лимфоциты, нормальные киллеры и другие клетки иммунной системы.

44

РИФ используют: 1) для изучения биосинтеза иммуноглобу- линов в плазмоцитах, их транспорта из клеток, иммуноглобу- линовых рецепторов В лимфоцитов; 2) для выявления титра антител при серодиагностике; 3) для выяснения закономерно- стей возникновения и развития злокачественных новообразо- ваний на клеточном и тканевом уровне и т.д.

Для постановки РИФ клетки с искомыми (или известными АГ) помещают на стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне 10 минут при комнатной температуре),

высушивают в течение 20 минут при 37 0 С, а затем обраба- тывают в зависимости от применяемого варианта РИФ.

После каждого этапа обязательна 2-х – 3- х кратная промывка буферным раствором для удаления не вступившего в реакцию иммунореагента.

Варианты постановки РИФ:

1Прямая РИФ (была предложена А. Кунсом в 1941 г.). Для каждого изучаемого АГ должна быть гомологичная

иммунофлюоресцентная сыворотка.

2. Непрямая РИФ (РНИФ) основана на использовании двух различных

антисывороток.

Вначале применяют немеченые АТ к искомому АГ (или искомые АТ в

сыворотке человека к известному АГ).

На 2-м этапе образовавшийся комплекс АГ-АТ обрабаты- вают антилюминесцентной сывороткой, содержащей ме- ченые флюорохромом АТ к иммуноглобулинам того вида животных, чья сыворотка использовалась на 1 этапе реак- ции.

3. Антикомплементарный метод РИФ (РИФСК) основан на способности

комплемента (сыворотки морских свинок) фиксироваться на иммунном

комплексе. В этом варианте используют люминесцент- ные сыворотки против

глобулинов (комплемента) морской свинки.

4.РГИФ (реакция гашения иммунофлюоресценции). Используется для выявления титра АТ в исследуемой сы-

воротке, при наличии известного клеточного АГ и специфической к нему лю-

минесцентной сыворотки.

На первом этапе на известный АГ наносят исследуемую сыворотку, и если в ней

есть соответствующие антигену антитела, они занимают эпитопы АГ. При

добавлении на втором этапе люминесцентной сыворотки к данным АГ,

присоединение люминесцентных АТ к эпитопам проис- ходить не будет.

Свечения не наблюдается.

СХЕМА:

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ:

1). В лабораторию поступили мазки-отпечатки мозговой тка- ни собаки, погибшей, как считают, от бешенства (рабдови- рус). В лаборатории имеется: люминесцентная антирабиче- ская сыворотка, буферные растворы.

Задание: Выявить клетки, пораженные вирусом бешенства РИФ (прямой вариант).

1.На мазки-отпечатки нанести люминесцентную антира- бическую сыворотку.

2.Инкубировать во влажной камере при комнатной тем- пературе 15-20 минут.

3.Мазки дважды тщательно промыть буферным раство- ром, подсушить на воздухе и просмотреть.

4.Для просмотра используют люминесцентный микро-

скоп.

5.В положительном случае клетки имеют яркое свечение, локализующееся по

периферии клетки.

2). Определить в лимфоцитарной массе наличие зрелых Т лимфоцитов, если в

лаборатории имеется : моноклональные антитела с СД3 меченые ФИТЦ.

1.25 мкл лимфоцитарной взвеси (концентрация 5000 в 1 мкл) поместить на предметное стекло в пространство, ограниченное окружностью, проведенной парафино-

вым стеклографом. Стекло поместить во влажную ка- меру и инкубировать 20 минут при 37 0 С для осажде- ния клеток. Остаток жидкости удалить фильтроваль- ной бумагой, прикладывая ее у края, чтобы не повре- дить монослой клеток.

2.Препарат промыть трижды в сосудах с физраствором. Удалить избыток влаги фильтровальной бумагой, не касаясь клеток (не допускать подсыхания).

3.На мазок нанести 25 мкл моноклональных АТ, мече-

ных ФИТЦ в рабочем разведении (1:50). Инкубиро- вать во влажной камере 40 минут при 37 0 С. Препарат промыть и просушить, как указано выше.

4.Для улучшения качества микроскопирования ядра лимфоцитов окрашивают ядерным красителем, на- пример, 0,001 % раствором бромида этидия. 15 мкл красителя наносят на препарат, через 15 минут промы- вают, как указано выше.

5.Клетки готовы для наблюдения иммунофлюоресцен- ции.

3)В лабораторию поступила мокрота от больного с подоз- рением на легочную форму