Механизмы Серологических Реакци Иммунология

Принципы получения растворимых антигенов Для изучения природы, функции и иммуногенности от-

дельных антигенных веществ, входящих в состав клеток или других сложных систем, а также для выявления антител к от- дельным антигенам, необходимо получить антигены в чистом виде. Это многоступенчатый процесс, требующий применения комбинаций различных методов.

Антигены прокариот и эукариот получают экстрагировани- ем различными растворителями целых или дезинтегрирован- ных клеток.

Так, из целых микробных клеток обычно экстрагируют ве- щества, которые нековалентно интегрированы в состав кле- точной стенки. Например, белок А золотистого стафилококка и липополисахарид наружной мембраны Гр (-) бактерий.

Чаще экстракции предшествует дезинтеграция клеток. Наиболее часто клетки разрушают: 1) механически в спе-

циальных приборах (дезинтеграторах и прессах); 2)клетки можно разрушить, воздействуя на них ультразвуком; 3) при помощи ферментов, которые разрывают ковалентные связи, разрушают отдельные клеточные структуры; 4) при помощи детергентов, которые связывают молекулы белков и липидов.

Полученную дезинтегрированную клеточную массу разде- ляют на отдельные клеточные компоненты, применяя различ- ные виды центрифугирования: дифференциальное, зональное, равновесное в градиенте плотности.

Отдельные антигены из дезинтегрированных или интакт- ных клеток, а также из их изолированных структур экстраги- руют дистиллированной водой, буферами, растворами кислот, щелочей и т. д.

Экстракты – это сложные смеси антигенов и дополнитель- ных балластных веществ.

11

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к натив-

ной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добав- ляют микроорганизмы, в состав которых входят все группо- вые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти- тела.

Такие адсорбированные моноспецифические антисыворот- ки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой) принадлежности и авидности, поскольку синтезируются раз- ными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ

Идентичными по всем характеристикам являются антитела к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е. моноклональные антитела.

Для иммунизации животных готовят корпускулярные или растворимые антигены различной степени очистки в зависи- мости от задач исследования.

Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требо- ваниям, во многом зависит от кратности, сроков и способов введения антигенов.

Способы введения антигенов животным могут быть раз- личными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и дру- гие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное вве- дение антигенов.

Количество антител в полученной сыворотке устанавлива- ют титрованием ее в соответствующей серологической реак- ции с гомологичным антигеном.

13

РЕАКЦИИ, ПРОТЕКАЮЩИЕ С УКРУПНЕНИЕМ АНТИГЕНА

1. Реакции агглютинации

Феномен агглютинации заключается в способности АТ (агглютининов) связываться с корпускулярными АГ (агглю- тиногенами), склеивая их в агрегаты (агглютинаты), кото- рые выпадают в осадок в присутствии электролита.

Механизм реакции агглютинации описывается теорией «решетки», согласно которой агглютинат образуется при со- единении одного активного центра 2-х валентного антитела с детерминантной группой АГ, а второго активного центра – с детерминантной группой другого АГ.

Рис. Схема реакции прямой агглютинации

По характеру агглютината различают зернистую и крупно- хлопчатую агглютинацию. Зернистая наблюдается при агглю- тинации безжгутиковых бактерий, хлопчатая - у жгутиковых бактерий.

14

Различают прямую и непрямую (пассивную) реакции агг- лютинации. Антигеном в прямой реакции агглютинации мо- гут быть микробные клетки, эритроциты, лейкоциты.

Способы постановки реакции агглютинации:

Существуют различные варианты постановки реакции агг- лютинации, из которых наиболее распространены пластинча- тая и объемная (развернутая) реакции.

Пластинчатую реакцию агглютинации выполняют на стеклянных или фарфоровых пластинках с гладкой и тща- тельно обезжиренной поверхностью для обеспечения растека- ния реагентов. Применяют ее как ускоренный ориентировоч- ный метод обнаружения антител, а также для идентификации клеточных антигенов (микробных, эритроцитарных, лейкоци- тарных). В зависимости от задач эксперимента в капле сыво- ротки на стекле агглютинируют известный диагностикум, ис- следуемые микробные или другие клетки. Этот вариант ре- акции агглютинации отличается простотой постановки и по- зволяет быстро анализировать большое количество проб сы- воротки или культур микроорганизмов. Положительная реак- ция прямой агглютинации на стекле имеет диагностическое значение только при использовании адсорбированных сыво- роток.

Рис. Пластинчатая реакция агглютинации

15

Развернутую реакцию агглютинации проводят в пробирках или в лунках полистероловых пластин с несколькими после- довательными разведениями сыворотки, в которые вносят одинаковые количества антигена. Эта реакция дает возмож- ность определить не только количество антител, но и иденти- фицировать микроорганизмы при использовании неадсорби- рованных сывороток.

Рис. Развернутая реакция агглютинация

В инфекционной патологии и эпидемиологии РА наиболее применима в следующих направлениях:

а) для выявления АТ у больного, носителя, переболевшего и иммунизированного.

Исследуемую сыворотку титруют в изотоническом (физио- логическом) растворе двукратно и последовательно (напри- мер, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) в пробирках лунках и добавляют корпускулярный антиген, чаще стандартные диагностикумы.

16

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий.

Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре- деленном титре сыворотки, который служит диагностическим. Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-

ремии -1:100.

Для выявления антител можно ставить экспрессные реак- ции агглютинации (время учета несколько минут). Например:

1.Кровяно-капельная реакция при туляремии. В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап- лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре- мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков.

2.На стекле проводится экспрессная реакция агглютина- ции по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество ан- тител в сыворотке.

б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин- фекционных болезней.

Сэтой целью используются иммунные диагностические агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтами вакцин и сывороток, путем иммунизации животных целыми микробными клетками.

Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор- бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот- ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.

17

При идентификации (серотипирования) чистой культуры возбудителя часто ставят ориентировочную пластинчатую ре- акцию агглютинации. На стекла вносят капли диагностиче- ских агглютинирующих сывороток, в которые вносят изучае- мую чистую культуру возбудителя. Результат учитывается через несколько минут.

Если сыворотки неадсорбированные – после ориентиро- вочной ставят развернутую реакцию агглютинации.

Принадлежность микроорганизма к данному виду или типу устанавливают лишь в том случае, если он агглютинируется соответствующей диагностической сывороткой не менее чем до ½ или ¾ ее титра.

Непрямые (пассивные) реакции агглютинаци

Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О- группы человека).

Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.

Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА).

Выпускаются коммерческие препараты – эритроцитарные диагностикумы (на эритроцитах нагружены известные моле- кулярные АГ), которые используются в РНГА для обнаруже- ния специфических АТ в исследуемой сыворотке и эритроци- тарные диагностикумы антительные (на эритроцитах нагру- жены Fc фрагментами известные АТ), которые применяются в РНГА для выявления АГ.

18

Реакцию обычно проводят с использованием пластмассо- вых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического ис- комого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде ге- магглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки».

Рис. . Схема реакции пассивной гемагглютинации:1− эритро- циты, 2− Аг эритроцита, 3 – конъюгированный Аг, 4 − Ат

Для идентификации возбудителей инфекционных болезней широко используется реакция коагглютинации. Для нее не- обходимы коагглютинирующие реагенты (Ко-А реагент). Они представляют собой взвесь золотистых стафилококков (S. aureus) штамма Cowan, на А белке которых нагружены Fc фраг- ментом Ат к искомым Аг. Реакцию коагглютинации ставят на стекле капельным методом.

19