Механизмы Серологических Реакци Иммунология

При визуальном учете реакцию расценивают как положи- тельную, если в лунках наблюдается достаточно интенсивное окрашивание, значительно превосходящее окрашивание в лунках с отрицательными контролями.

ИФА обладает следующими преимуществами:

-высокой чувствительностью, позволяющей выявлять кон- центрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента ката- лизировать превращение большого числа молекул субстрата;

-возможностью использовать минимальные объемы иссле- дуемого материала;

-стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходи- мых для проведения ИФА (до года и более);

-простотой проведения реакции;

-наличием как инструментального (в качественном и количе- ственном варианте), так и визуального учета.

ПРИМЕНЕНИЕ ИФА.

Методы ИФА широко используются в различных областях биологии и медицины.

Иммуноблотинг ( ИБ)

В основе этого метода лежит использование нитроцеллю- лозных полосок, на которые методами горизонтального и за- тем вертикального электрофореза переносятся АГ в порядке нарастания их молекулярных масс.

При проведении исследования эти полоски, помещенные в индивидуальные пластиковые кюветы, последовательно взаимодействуют с сывороткой (иммунной или испытуе- мой), конъюгатом и субстратом в условиях горизонтального встряхивания с целью перемешивания и равномерного взаи- модействия реагентов с полоской по всей ее длине.

После завершения контакта с очередным ингредиентом по- лоску промывают специальным раствором для удаления не- связавшихся компонентов.

При наличии специфичности искомых АГ (АТ) известным АТ (АГ) они связываются в иммунные комплексы в опреде- ленных зонах полоски. К этому комплексу присоединяются конъюгат, представляющий собой антивидовые антитела, меченые пероксидазой или другим ферментом. После кон- такта с субстратом, в местах связывания образуется окра- шенный продукт, по локализации и интенсивности окраши- вания которого делают визуальное заключение о реакции.

Радиоиммунологический анализ (РИА) – это методики, в кото-

рых наличие ИК определяется с помощью радиоактивной метки, предварительно введенной в состав антител или анти- генов.

Наиболее широко используют две разновидности РИА: ра- диоиммунопреципитация (РИП) и твердофазный радиоим- мунологический анализ (ТФ РИА). В качестве радиоактив- ной метки используюи три типа изотопов – 3Н, 14С,

(или 131 I ). Наиболее популярный способ получения коъю- гатов – метка радиоактивным иодом, т.к. этот метод введе- ния метки практически не снижает иммунологической ак- тивности антигенов и антител в процессе формирования ИК. Чаще всего в РИА используется Y-изотоп – 125I, имеющий более длительное (60 дней) время полураспада, чем радио- нуклеоид 131 I (8 дней).

Методика РИП заключается в 1) формировании в растворе радиоактивного иммунного комплекса (при предваритель- ном введении в состав одного из участников реакции анти- ген-антитело радиоактивной метки), 2) отделении этого ком- плекса от не вошедших в него макромолекул, 3) анализе его радиоактивного компонента.

Отделение ИК от макромолекул проводится с помощью раз- личных физико-химических методик: электрофореза в геле, агарозе, адсорбцией на различных органических и неоргани- ческих поверхностях и т.д., но наиболее часто для отделения ИК используется метод «двойных антител», в котором ком-

плекс антиген-антитело утяжеляется с помощью его взаимо- действия с антивидовыми иммуноглобулинами, специфич- ными к антителам, вошедшим в ИК. После формирования вторичного ИК высокомолекулярный преципитат отделяют фильтрацией или центрифугированием. . Далее проводят количественный и качественный анализ радиоактивного компонента преципитата. РИП можно проводить либо в прямом, либо в конкурентном варианте.

ТФ РИА заключается в формировании ИК не в растворе , а на твердой фазе, где предварительно иммобилизируют антиген или антитело. На иммобилизированный антиген (или анти- тело) последовательно сорбируются остальные компоненты ИК. Такая методика дает возможность удалять из смеси не вошедшие в ИК макромолекулы с помощью простой про- мывки. Наиболее простым вариантом ТФ РИА является пря- мой анализ, основанный на эффекте прямой адсорбции анти- гена на твердую фазу. В настоящее время основными мето- диками ТФ РИА являются варианты «сэндвича».

Первый вариант наиболее прост в постановке: ( в диагно- стические наборы на его основе входят только два иммуног- лобулиновых препарата, один из которых адсорбирован на твердой фазе).

Второй вариант отличается тем, что на его основе удобно конструироовать диагностические системы – в состав которых

входят антивидовые иммуноглобулины, меченые радиоак- тивно.

Распространены и конкурентные варианты, когда содержа- щиеся в исследуемом образце АГ или АТ конкурируют с аналогичным радиоактивно меченым ингредиентом за право образовать ИК.

Метод РИА считается одним из наиболее чувствительных иммунохимических методов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ:

Какие еще иммунореагенты необходимы для постанов- ки сэндвич варианта ИФА?

Поставить реакцию:

-На полистироловые шарики с адсорбированными АТ на- нести НВs- АГ и выдержать

втермостате 30 минут при 37о .

-Промыть буфером .

-Нанести исследуемую сыворотку и выдержать в термо- стате 30 минут при 37о.

-Промыть буфером.

-Нанести конъюгат (АТ к YgМ человека, меченые фер-

ментом) и выдержать 30 минут при 37о.

-Промыть буфером.

-Внести субстрат, выдержать 30 минут.

-Учесть реакцию.

2 а. В исследуемой сыворотке выявить наличие АТ ( Yg M ) к HBs – АГ, если в

лаборатории имеется:

1.Полистироловые планшеты, в лунках которого ад- сорбированы АТ к мю-

цепям YgМ

2.HBs – АГ.

3.АТ к НBs-АГ, меченые ферментом (ПХ ).

4.Субстрат ( ОФД ).

5.Буферный раствор.

Можно ставить ИФА (сэндвич-вариант)

∙В лунки внести исследуемую сыворотку (Yg М? к НВs-АГ ). Выдержать 30 минут при 37о

∙Промыть буфером.

∙ Добавить НВs- АГ. Выдержать 30 минут при 37о

∙Промыть буфером.

∙Внести конъюгат (АТ к НВs-АГ, меченые фермен- том). Выдержать 30 минут при 37о.

∙Промыть буфером.

∙Внести субстрат. Выдержать 30 минут в темноте.

∙Учесть реакцию.

3.Определить титр АТ к токсоплазменному АГ, если имеет-

ся:

1. Исследуемая сыворотка.

2. Полистироловые планшеты.

3. Токсоплазменный АГ.

4. Сыворотка против Yg человека, конъюгированная ферментом ( ПХ )-конъюгат.

5. Субстрат для ПХ (ортофенилендиамин).

6. Буферные растворы.

Можно провести ИФА (непрямой вариант).

*В лунки внести токсоплазменный АГ. Адсорбировать его 18-20 часов при

комнатной температуре.

*Внести в лунки с АГ исследуемую сыворотку в разных разведениях ( 1:5, 1:10,

1:20, 1:40).

*Выдержать в термостате 30 минут при 37о.

*Промыть буфером.

*Внести конъюгат. * Выдержать в термостате 30 минут при 37о.

*Промыть буфером.

*Внести субстрат. Выдержать в темноте 30 минут.

*Учесть реакцию.

4.В исследуемой сыворотке определить наличие АТ к НСV, если в лаборатории имеется:

1.Полистироловые шарики с адсорбированными АГ НВV.

2.Иммунная сыворотка к НСV меченная изотопом 125J .

3.Буферный раствор.

Можно поставить РИА (конкурентный вариант).

*На полистироловые шарики с НСV-АГ нанести иссле- дуемую сыворотку.

*Нанести иммунную сыворотку к НСV-АГ меченную изо- топом 125J.

*Промыть буфером. *Учесть реакцию.

ОСНОВЫ МЕТОДА ПЦР.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраива- ние ДНК матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фер- мента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репли- кации ДНК. Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1)Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхож- дение нитей ДНК);

2)Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (за- травок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3)Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфек- ционных заболеваний.

1. Прямое определение наличия возбудителей.

Многие традиционные методы диагностики, например им- муноферментный анализ,

выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизне- деятельности инфекционных агентов, что дает лишь опо- средованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфек- ции.

2. Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, харак- терный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

3. Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает на- личие возбудителей инфекционных заболеваний в тех слу- чаях, когда другими методами (иммунологическими, бак- териологическими, микроскопическими) это сделать не- возможно.

4. Универсальность процедуры выявления различных возбу- дителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного ор- ганизма.

5.Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автомати- зация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4,5 часа.

6. Возможность диагностики не только острых, но и латент- ных инфекций.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, по- скольку этот метод позволяет избежать сложностей, свя- занных с выращиванием таких микроорганизмов в лабора- торных условиях. Применение ПЦР-диагностики также

очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полу- ченном от больного, но и в материале, получаемом из объ- ектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Недостатки ПЦР.

1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего мик- роорганизма.

Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежу- ток времени, в течение которого происходит полная эли- минация возбудителя Обычно этот интервал составляет 4-8 недель.

2. Возможность перекрестной реакции.

Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов. Тео- ретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были про- тестированы на возможность перекрестной реакции. При- сутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату реакции.

3.Изменчивость микроорганизмов.

Хотя при конструировании тест-системы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высоко консервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать му- тации в амплифицируемом участке генома, и, таким обра- зом становиться неуловимыми данной тест-системой. Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР- диагностикумов. В настоящее время разработаны стандар-

ты, регламентирующие объем испытаний (включая провер- ку на перекрестные реакции, а также тестирование извест- ных штаммов определяемого возбудителя), которые долж- на выдержать тест-система, прежде чем она попадет на ры- нок.

Применение ПЦР в практическом здравоохранении.

Использование метода ПЦР для диагностики инфекцион- ных заболеваний как бактериальной, так и вирусной при- роды имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаменталь- ных исследований в области изучения хронических и мало- изученных инфекционных заболеваний. Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традици- онных методов. Используемых в микробиологической ди- агностике. Наиболее рационально и эффективно примене- ние ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно куль- тивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные парази- ты и микроорганизмы, способные длительно персистиро- вать в организме хозяина.

Показания к применению метода ПЦР при различных забо- леваниях.

1.Применение ПЦР в урогинекологической практике.

2.Применение в неопатологии.

3.Применение ПЦР в практике службы крови.

4.Применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии.

5.Применение ПЦР в клинике инфекционных заболева-

ний.

6.Применение ПЦР в иммунологии.

7.Применение ПЦР в онкологии и др.