Практическое занятие № 3

Тема: «Ферменты.

Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций. Специфичность ферментов»

(лабораторно-практическое занятие)

Мотивация: знания химической природы ферментов, механизма их действия необходимо для понимания природы биокатализа и дальнейшего изучения свойств ферментов

Цель обучения, воспитания и развития: закрепить представления о химической природе ферментов, особенностях ферментативного катализа, специфичности ферментов, принципе обнаружения ферментов

Задачи, обучения, воспитания и развития: студент должен

1. Уметь писать формулы:коферментов НАД, ФМН

2. Знать и уметь объяснять значения терминов: ингибитор, органо­­специфические ферменты, аллостерические ферменты, изоферменты, коферменты.

Этапы проведения занятия:

1. Вводная часть

2. Основная часть занятия: лабораторная работа,

семинар (общие и индивидуальные задания для СДС)

3. Заключительная часть занятия (тест-контроль)

Задание на самоподготовку:

1. История открытия и изучения ферментов. Роль ферментов в процессах жизнедеятельности. Изменение активности ферментов в тканях и биологических жидкостях.

2. Механизм действия ферментов. Энергетический барьер реакции. Особенности фермента­тивного ка­та­лиза. Снижение энергии активации реакций в процессе катализа.

3. Строение ферментов. Активный центр. Кофакторы и коферменты ферментов, роль

витаминов. Специ­фичность действия ферментов, связь со строением активного центра. Возможность транс­формации.

4. Международная классификация и номенклатура ферментов. Шифр ферментов. Классификация ферментов по их локализации в органах и клетках.

5. Ингибиторы ферментов: обратимые и необратимые, конкурентные.

6. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, pH, концен­трации фермента и субстрата. Индукция и репрессия фер­мен­тов. Значение разработки этих вопросов для практической медицины.

Ориентировочная основа деятельности студентов (оод) для проведения лабораторной работы: Работа №1. Термолабильность ферментов

Принцип метода. Термолабильность фермента – чувствительность ферментов к температуре, при которой протекает ферментативная реакция. Для большинства ферментов максимальная скорость реакции наблюдается при 37-40⁰С (температурный оптимум). При нагревании выше 50-60⁰С ферменты утрачивают свои каталитические свойства вследствие тепловой денатурации. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа резко снижается. Свойство ферментов инактивироваться при кипячении можно продемонстрировать на примере действия амилазы слюны. Об активности фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции

Фермент α-амилаза (КФ 3.2.1.1) содержится в слюне и катализирует гидролиз α-гликозидной связи крахмала по следующей схеме:

Крахмал (реакция с йодом дает синее окрашивание)

↓

декстрины (реакция с йодом дает фиолетово-бурое окрашивание)

↓

мальтоза

↓

глюкоза (реакция с йодом - отрицательная.

Реакция Троммера на свободные альдегидные группы

в глюкозе положительная)

Порядок выполнения работы:

1. Получение разведенной слюны: слегка ополаскивают рот дистиллированной водой для очищения его от остатков пищи, набирают новую порцию воды (15-20 мл) и задерживают во рту примерно на 3 мин. Ротовую жидкость сливают в стаканчик и используют для исследований.

2. 2-3 мл слюны отбирают в пенициллиновый флакон и кипятят 5 минут на плитке , после чего охлаждают

3. В 3 пенициллиновых флакона наливают по 10 капель 1% раствора крахмала,

в 1-й добавляют 10 капель нативной слюны

во 2-й добавляют 10 капель кипяченой слюны

в 3-й добавляют 10 капель дистиллированной воды (контроль)

4) все пробы помещают в термостат (38⁰ С) на 10 минут

5) по истечении срока инкубации содержимое каждого флакона делят на 2 части и

проводят качественные реакции на крахмал и глюкозу (реакция Троммера)

Реакция на крахмал: приливают 1 каплю 0,1% раствора J₂ в KJ.

В присутствии крахмала появляется синее окрашивание.

Реакция Троммера: приливают 5 капель 10% раствора NaOH и 3 капли 1%

раствора CuSO₄, затем кипятят в течение 1 минуты. Появление красного

окрашивания свидетельствует о присутствии глюкозы.

Сравните окрашивание растворов в полученных пробах. Укажите в выводах, какое влияние оказывает высокая температура на активность фермента, чем оно обусловлено и как доказывается.

Клинико-диагностическое значение: термолабильность ферментов учитывается в практической медицине в следующих случаях:

1. для рационализации терапевтических приемов при развитии воспалительного процесса, сопровождающегося изменением терморегуляции (повышение температуры тела при лихорадочных состояниях);

2. снижение интенсивности метаболических процессов путем гипотермии при выполнении тяжелых хирургических манипуляций с целью уменьшения осложнений (кардиохирургия).

3. Снижение активности ферментов при охлаждении позволяет сохранять жизнеспособность клеток, тканей, органов (кровь, почки и др..) для трансплантации (метод низкотемпературной консервации).