dis_dovzhenko_nina_aleksandrovna

51

коротких, так и длинных времен «жизни» поверхности [34, 65]. Для более точной характеристики взаимосвязи между параметрами ДПН и биохимическими показателями у разных видов животных при исследовании биологических жидкостей в частности сыворотки крови, авторами проводился корреляционный анализ между ними, и рассчитывались коэффициенты корреляции, устанавливалась их степень влияния друг на друга.

Так, у крупного рогатого скота и лошадей липиды имеют отрицательную корреляцию с большинством показателей ДПН. При этом у коров влияние липидов в большей степени обусловлено уровнем холестерола, а у лошадей – триглицеридов. У обоих этих видов катионы имеют положительную корреляцию с ДПН при средних (σ2) и больших (σ3)

временах, а на значения углов наклона начального и конечного участка тензиограммы могут влиять по-разному [70, 71]. У кобыл содержание калия и натрия оказывает наибольшее влияние на параметры ДПН сыворотки крови,

в то время как у коров – содержание кальция.

Уровень мочевины у обоих видов животных (крупного рогатого скота и лошадей) имеет сильную положительную корреляцию с показателями ПН при коротких временах и с углом наклона начального участка кривой (λ0).

Уровень глюкозы у кобыл и коров имеет сильную отрицательную корреляцию связь со значениями ДПН и углами наклона, в то время как у коров корреляционная связь отмечается только при коротких временах.

Изменение содержания хлоридов в крови у коров и кобыл имеет прямую корреляционную связь со значениями ДПН при коротких временах и углами наклона тензиограмм (λ0 и λ1). У коров отмечается также сильная обратная корреляционная связь между уровнем хлоридов и ПН при больших временах существования поверхности (σ3) [70, 71] .

При составлении литературного обзора проанализирован ряд отечественных (100) и зарубежных (52) литературных источников. Было установлено, что в большинстве материалов приводятся средневидовые нормы физиолого-биохимических параметров обмена веществ, вне зависимости от возраста животных. В зарубежной литературе имеются данные о нормальных значениях данных показателей у молодняка сельскохозяйственных и домашних животных, но чаще всего они приводятся в специальных книгах по неонатологии и имеют неполный, недостаточный характер. В работах отечественных ученых выявление возрастных особенностей физиолого-биохимических показателей чаще всего проводится параллельно с какими-либо другими исследованиями, а отдельно систематизированных данных не имеется.

Таким образом, является актуальным установление значений физиолого-биохимических показателей БАВ и определение динамического поверхностного натяжения сыворотки крови как интегральной характеристики сыворотки крови в разные фазы постнатального онтогенеза для животных с разным типом обмена веществ.

53

2. Материалы и методы исследований

2.1. Объекты и материалы исследований

Объекты исследований

Исследования проведены на свиньях, принадлежащих ЗАО «СП-

Поволжское» филиал «Племзавод» «Гибридный» (Самарская область); котах из приюта Благотворительного фонда защиты животных «БИМ» (г. Москва);

собаках Центра кинологической службы (ЦКС) Управления на транспорте МВД России по ЦФО (г. Москва).

Объектами исследований были физиологически здоровые животные:

1) чистопородные свиньи крупной белой породы (свинки) в зависимости от возраста: 5, 10, 20, 60, 90,120 и 210 суток. Животные (всего 35 животных)

были разделены на группы по возрасту по 5 голов в каждой;

2) коты домашней короткошерстной породы были разделены на возрастные группы: 6 месяцев (3 животных), 1 год (3 животных), 6 (5 животных) и 13 лет

(5 животных); всего 16 животных; 3) собаки породы немецкая овчарка, в зависимости от возраста они были

разделены на группы: 6 месяцев (3 животных), 1 год (4 животных), 6 лет

(4 животных) и 13 лет (3 животных); всего 14 животных.

Условия содержания и кормления животных, исследуемых групп

Свиньи содержались в помещениях, где основные показатели температурно-влажностного режима соответствовали рекомендуемым ОНТП-2-77 [47, 81]. Для кормления племенного поголовья свиней всех возрастных групп на племзаводе применялся сухой тип кормления полноценными комбикормами различных марок, согласно утвержденным нормативам (Таблица П 1) [79].

Коты содержались в помещениях, соответствующих санитарно-

гигиеническим нормам [47,64]. Кормление осуществляли 3 раза в день в соответствии с нормами (Таблицы П 2а и П 2б) [50, 64].

Собаки содержались в специальных помещениях с кабинами, к

которым примыкают вольеры; у каждого животного свой. В кабине имеется

54

разборная будка стандартного размера. Условия содержания соответствовали ветеринарно-санитарным и противопожарным нормам [47, 64]. Корм животные получали 2 раза в день, в соответствии с нормами кормления

(Таблицы П 3а и П 3б) [84, 98].

Материалы исследований

Материалом для проведения исследований служила сыворотка крови животных исследуемых групп. Кровь брали перед утренним кормлением

(натощак).

Усвиней кровь брали из краниальной полой вены. После частичной ретракции кровяного сгустка сыворотку отделяли путем центрифугирования

втечение 15 минут при 3000 об./мин.

Укотов и собак кровь брали из передненаружной плюсневой вены,

расположенной на наружной поверхности голени. После частичной ретракции кровяного сгустка сыворотку отделяли путем центрифугирования в течение 15 минут при 2500 об./мин.

2.2.Методы исследований

Укаждого животного определяли стандартные физиологические показатели состояния организма. В пробах сыворотки крови животных определяли уровень показателей азотистого и белкового, липидного,

углеводного, водно-электролитного и минерального обменов, активность ферментов на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Chem-7» (ФРГ, ERBA DIAGNOSTICS MANNHEIM GmbH) с использованием реактивов «Ольвекс Диагностикум» (Россия) и «Human» (ФРГ) и

динамическое поверхностное натяжение на тензиометре ВPA-1P (Maximum Bubble Pressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies) по методам,

описанным ниже.

Определение физиологических показателей состояния организма

Для контроля за состоянием здоровья животных всех исследуемых групп перед началом эксперимента определили температуру, частоту

55

сердечных сокращений (частоту пульса), частоту дыхательных движений по общепринятым методикам [44, 112, 113].

Методы определения физиолого-биохимических параметров азотистого и белкового обменов

Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом. Он основан на том, что белок образует окрашенный комплекс фиолетового цвета с ионами меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в пробе [51,52, 67, 106].

Уровень альбуминов определяли унифицированным колориметрическим методом с бромкрезоловым зеленым. Альбумины образуют окрашенный в синий цвет комплекс с бромкрезоловым зеленым в слабокислой среде в присутствии детергента [52, 67].

Количество мочевины определяли уреазным-глутаматдегидрогеназным кинетическим методом. Он основан на оптическом тесте Варбурга с использованием сопряженных ферментативных реакций, приводящих к образованию в инкубационной среде NAD:

уреаза

мочевина + H2O 2 NH3 + CO2

глутаматдегидрогеназа

NH3 +α-кетоглутарат + NADH2 L - глутамат + NAD + H2О

Скорость окисления NADH2 в NAD пропорциональна концентрации мочевины в пробе [52, 94].

Определение содержания мочевой кислоты проводили энзиматическим колометрическим метод без депротеинизации. Принцип метода [18, 146]:

уриказа

Мочевая кислота + 2H2О + О2 аллантоин + CO2+H2O2

пероксидаза

H2O2+3,5-дихлоро-2-фенолсульфанат+4-аминоантипирин хинонимин+4H2О

Уровень креатинина определяли псевдокинетическим методом на основе реакции Яффе без депротеинизации. Принцип метода основан на том,

что скорость образования окрашенного комплекса креатинина с пикриновой

56

кислотой в щелочной среде пропорциональна концентрации креатинина в пробе [52, 67].

Уровень общего и прямого билирубина определяли по диазореакции

(методом Йендрассика-Грофа). Принцип метода основан на том, что прямой

(связанный, конъюгированный с глюкуроновой кислотой) билирубин не-

посредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а

общий билирубин - в присутствии кофеинового реагента с образованием окрашенного азосоединения. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации билирубина [52,67].

Методы определения физиолого-биохимических параметров липидного обмена

Уровень общего холестерола определяли энзиматическим колориметрическим методом. Его принцип основан на том, что холестерол из состава эфиров высвобождается под действием фермента холестерол-

эстеразы (ХЭ). При участии фермента холестеролоксидазы (ХО) холестерол окисляется до 4-холестен-3-она. Образующаяся перекись водорода, при участии фермента пероксидазы, способствует окислительному азосочетанию

4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель).

ХЭ

эфиры холестерола + Н2О холестерол + жирные кислоты

колориметрическим методом. Он основан на том, что липаза катализирует гидролиз липидов до глицерина и жирных кислот. Глицерин запускает ряд сопряженных ферментативных реакций с участием ферментов

58

Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию глюкозы в исследуемом материале и определяется фотометрически [38, 124, 167, 181].

Методы определения физиолого-биохимических параметров минерального и водно-электролитного обменов

Уровень общего кальция в сыворотке определяли унифицированным колориметрическим методом с о-крезолфталеин комплексоном. Принцип данного метода основан на том, что кальций в щелочной среде образует окрашенный комплекс с о-крезолфталеин комплексоном. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации общего кальция в пробе [39].

Количество неорганического фосфора определяли спектрофотометрическим методом. Он основан на способности фосфат-ионов образовывать в кислой среде с молибдатом аммония в присутствии детергента фосфорномолибдевовый комплекс, его оптическая плотность пропорциональна концентрации неорганического фосфора в исследуемом образце [153, 167].

Количество магния определяли колориметрическим методом без депротеинизации. Магний образует окрашенный комплекс с ксилидиловым синим. Интенсивность окраски комплекса пропорциональна концентрации магния в пробе [52, 107].

Калий определяли нефелометрическим методом без депротеинизации.

Он основан на том, что в результате реакции между ионами калия и тетрафенилбората образуется стабильная суспензия. Мутность суспензии пропорциональна концентрации ионов калия [107].

Содержание натрия определяли колориметрическим методом. Он основан на связывании натрия с ионами осаждающего реагента с образованием нерастворимого комплекса. Оставшиеся в растворе ионы осаждающего реагента образуют окрашенное соединение с тиогликолятом.

Интенсивность окраски реакционной среды обратно пропорциональна

59

содержанию натрия в исследуемом материале и определяется

фотометрически [107].

Содержание хлоридов определяли фотометрическим методом с

использованием тиоцианата. Принцип метода основан на том, что хлориды высвобождают эквивалентное количество тиоцианата из тиоцианата ртути

(II). Тиоцианат образует с ионами железа комплекс красного цвета,

светопоглощение которого пропорционально концентрации хлоридов [85].

Методы определения активности ферментов в сыворотке крови

Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) определяли

энзиматическим кинетическим методом (стабилизированные растворы).

Под действием фермента АлАТ в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Образующийся в данной

реакции пируват при участии фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и

кофермента NАDН2 превращается в лактат.

Скорость окисления NАDН2 в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды и пропорциональна активности АлАТ [48, 52, 124].

Активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) определяли энзиматическим кинетическим методом. Под действием фермента АсАТ в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции оксалоацетат при участии фермента малатдегидрогеназы (МДГ) и кофермента NАDН2

превращается в малат.

АсАТ

Скорость окисления NАDН2 в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды и пропорциональна активности АсАТ [48, 52, 124].

Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови животных определяли оптимизированным кинетическим методом. Принцип метода основан на том, что скорость окисления NADH в NAD+ пропорциональна активности ЛДГ [49, 77, 124]:

Активность креатинкиназы (КК) определяли энзиматическим кинетическим методом:

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Глюкозо-6-фосфат + NADР+ 6-фосфоглюконат + NADРН + Н+

Cкорость восстановления NADР+ в NADРН в пропорциональна активности креатинкиназы в пробе [124].

Активность γ-глутамилтрансферазы (ГГТ) в сыворотке крови определяли кинетическим методом. Принцип метода заключается в том, что ГГТ катализирует перенос γ-глутамиловой группы с синтетического субстрата L-γ-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид на глицилглицин.