14. Способы выделения мутантных штаммов с дефектами метаболитической регуляции.

Для получения мутантных штаммов разрабатывают эффективные методы. селекцию Для обогащения культуры бактерий (грибов) ауксотрофными мутантами применяют пенициллин, нистатин и другие антибиотики. Подбирают условия, когда клетки дикого штамма, которые растут без определенной аминокислоты, погибают в присутствии антибиотика; последний действует только на растущие клетки. Ауксотрофные мутанты, которые нуждаются в этой аминокислоте, не растут и сохраняются.

Применяя мутагены, можно повысит частоту мутации до 10⁵ - 10⁸ клеток. Для получения мутантов можно применять ультрафиолетовое и γ-облучение, химические мутагены - нитриты, гидроксиламин, нитрозометилгуанидин, этилметансульфонат. В последнем случае среди выживших клеток оказывается 1-10% ауксотрофных мутантов. Хотя индуцированный мутагенез и ступенчатая селекция чрезвычайно трудоемкие методы, а в результате непредсказуемы, успехи в создании высокопродуктивных мутантных штаммов впечатляющи, что видно на примере селекции продуцентов пенициллина. Если природные штаммы могли синтезировать 100 ед./мл антибиотика, то современные промышленные штаммы синтезируют до 40000 ед./мл. Преимуществом ступенчатого отбора является то обстоятельство, что часто успеха добиваются без знания о путях биосинтеза целевого продукта и генетического обмена. Недостатком метода является неспецифичность мутации, что приводит к возникновению, помимо нужных мутаций, вредных, снижающих жизнедеятельность штаммов и требующих витаминов, аминокислот и пр. для роста, что удорожает питательную среду.

Для отбора мутантов с дефектом регуляции используют 2 надежных приема современной селекции:

1. получение штаммов, устойчивых к структурным аналогам целевого продукта ("антибетаболитов");

2. выделение реверантов из ауксотрофных мутантов.

Антиметаболиты - соединения, структурно анологичные целевому метаболиту, как, например, метионин и этионин - СН₃S(CH₂)₂ - CH(NH₂)COOH и CH₃CH₂S(CH₂)_2­­ ­­- CH(NH₂) x COOH, - а также токсичные для продуцентов целевых соединений. Клетка "путает" антиметаболит с метаболитом. Механизм токсичности антиметаболита может включать нарушение и снижение скорости синтеза белка ферментов (антиметаболит подавляет синтез аминокислоты, входящей в состав белка), конкурентное связывание ферментов, катализирующих превращение метаболитов, снижение активности алостерических ферментов, торможение или прекращение роста нормальной клетки (так как аналог включает синтез метаболита по обычной схеме) и т. д. Экспонирование мутагенезированной популяции клеток с антиметаболитами приведет к гибели большинства клеток и к отбору, выживанию резистентных (устойчивых) мутантов; те из них, которые преодолели барьер регуляции, будут способны к сверхсинтезу целевого метаболита. Селекция с аналогами обычно дает очень хорошие результаты.

Второй метод предусматривает использование ауксотрофных мутантов, которые при выращивании на недостаточно сбалансированной питательной среде становятся ревертантами вследствие восстановления (реверсии) у них потребности к синтезу конечного продукта. В ревертантах синтезируются ферменты с таким изменением структуры, что они, сохраняя каталитическую активность, теряют способность к аллостерической регуляции. Иначе говоря, модифицированные ферменты уже не связывают ингибитор (конечный продукт), функционирующий по принципу обратной связи (дефект в аллостерических ферментах). Можно изменить и регуляторные ферменты (сайты) генов так, что избыток продукта не будет влиять на интенсивность их синтеза. Таким образом, ауксотрофная мутация и реверсия (с помощью вторичных мутаций) ведут к продуцированию и выделению в культуральную среду большого количества целевого продукта.