12.Механизмы регуляции микробного метаболизма: катаболитная репрессия. Кроме репрессии конечным продуктом, характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно используемых источников энергии.Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь наиболее легко доступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов временно выключаются.Известно, что если в среде для выращивания E.coli одновременно содержатся глюкоза и лактоза , сначала используется глюкоза. Несмотря на присутствие индуктора лактозного оперона , ферменты, участвующие в катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона.Как это осуществляется? Изучение механизма катаболитной репрессии обнаружило, что этот тип регуляции тесно связан с внутриклеточным уровнем циклического АМФ (цАМФ) , который в этом процессе функционирует в качестве эффектора . Он образует комплекс с аллостерическим белком - катаболитным активатором, не активным в свободном состоянии. Этот комплекс, присоединившись к определенному участку на промоторе , обеспечивает возможность связывания РНК-полимеразы с промотором и инициацию транскрипции. Количество образующегося комплекса определяется концентрацией цАМФ, которая уменьшается пр увеличении содержания глюкозы в среде. Таким образом, глюкоза вызывает изменение внутриклеточной концентрации цАМФ. Это соединение обнаружено в клетках всех прокариот. Его единственная функция - регуляторная.Циклический АМФ образуется из АTФ в реакции, катализируемой аденилатциклазой , связанной с ЦПМ :АТФ обратимо переходит в цАМФ + пирофосфат.Аденилатциклаза обладает высокой активностью, если компоненты системы транспорта глюкозы в клетку фосфорилированы. Это происходит в отсутствие глюкозы, которую необходимо транспортировать. Таким образом, активность аденилатциклазы возрастает при уменьшении концентрации глюкозы в среде. Последнее приводит к повышению образования цАМФ и в конечном итоге к индукции синтеза ферментов катаболизма лактозы. Наоборот, при высокой концентрации глюкозы в среде система ее транспорта находится в дефосфорилированном состоянии, следствием чего является уменьшение активности аденилатциклазы и соответственно количества цАМФ. Таким способом глюкоза через систему своего транспорта регулирует концентрацию цАМФ в клетке.Поскольку катаболизм глюкозы связан с образованием метаболической энергии и запасанием ее в молекулах АТФ, через глюкозу в клетке связаны пулы АТФ и цАМФ: при увеличении количества АТФ уменьшается количество цАМФ, и наоборот.Особенностью всех ферментных систем, находящихся под контролем катаболитной репрессии, является участие в их индукции универсального комплекса, состоящего из белкового катаболитного активатора и цАМФ.

13.Использование мутационных дефектов регуляции микробного метаболизма с целю получения сверхпродуцентов бав.

Аллостерические ферменты, подверженные ингибированию по принципу обратной связи, состоит из двух белковых субъединиц: субстратсвязывающей, несущей на себе каталитический центр, и регуляционной (аллостерической), служащей центром связывания ингибитора, действующего по принципу обратной связи. Временное занятие центра ингибитором, конечным метаболитом (или аллостерическим эффектором) приводит к конформационному изменению белковой макромолекулы фермента, затрудняющему прикреплению субстрата к центру его связывания. Мутация меняет конформацию белка таким образом, что теряется активность по отношению аллостерическому эффектору, но не каталитическая. Это приводит к образованию избыточного количества соответствующего конечного продукта. Репрессия синтеза ферментов, необходимых, например, для образования аминокислот, обуславливается рядом реакций в специфических генах, детерменирующих синтез этих ферментов. Если ген-регулятор i закодирован на продуцирование внутриклеточного неактивного белка-репроссора (апорепрессора), а соответствующий конечный продукт - аминокислота - представлен в клетке в малых концентрациях, то ген-оператор o не будет блокирован белком-арепрессором, РНК-полимераза сможет перемещаться от гена-промотора р и транскрибировать структурный ген. Следовательно, будут образовываться необходимые для синтеза аминокислоты ферменты, например аспартаткиназы - конститутивные ферменты.

Напротив, при высоких концентрациях в клетке аминокислоты или когда она содержится в питательной среде, апорепрессор активируется аминокислотой или продуктом её превращения, например комплексом аминоацил-тРНК. Затем активированный апорепрессор (холорепрессор) взаимодействует с геном-оператором и предотвращает транскрипцию структурного гена в мРНК; следовательно, ферменты образовываться не будут.

Мутации (дефект) генов i или o приводит либо к образованию дефектного апорепрессора, не способного взаимодействовать даже с избытком аминокислоты, или к возникновению неактивной в отношении к холорепрессору конформации структурного гена; в обоих случаях эффект одинаков. В таких мутантах наблюдают, как правило, сверхпродуцирование ферментов, а значит целевой аминокислоты. Следствием этих дефектов может быть индукция ферментов. При этом индуцибельные ферменты становятся конститутивными, т. е. не зависят от наличия субстрата в клетке, а катаболитная репрессия исчезает. Мутанты с дефектами регуляции принято называть регуляторными мутантами; их функцией является синтез конститутивных ферментов.

Наконец, включение механизма ингибирование по принципу обратной связи - еще одного регуляционного способа контроля жизнедеятельности микроорганизма - достигается при наличии в штамме-продуцента мутационного нарушения регуляции, дефекта (разрыва) в биохимической последовательности образования конечного продукта. Способность клетки к образованию и накоплению внутриклеточных конечных продуктов - ингибиторов ограничивается, поскольку отсутствует (или включен) соответствующий фермент При ограничении накопления конечного продукта становится возможным рост клеток продуцента. В то же время в клетке накапливаются высокие коцентрации промежуточного целевого продукта. Мутанты с ограничение накопления конечных продуктов метаболизма принято называть ауксотрофными.

Часто сверхпродуценты являются многократными мутантами, которые имеют оба вида дефектов (ауксотрофно-регуляторные мутанты).