8_054

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ АРНИКИ: КРЕМ «АРНИЛЕК», ГЕЛЬ «АРНИЛЕК», ЛИНИМЕНТ «АРНИЛЕК» ПРИ МЕХАНИЧЕСКИХ, ТЕРМИЧЕСКИХ И ЛУЧЕВЫХ ПОРАЖЕНИЯХ КОЖИ

Куценко С.А., Данилив М.В., Башарин В.А., Иванов М.Б., Василевич С.В., Заргарова Н.И.

г. Санкт-Петербург

Существующий в мире высокий интерес к лекарственным средствам из природного сырья сопровождается повышением требований к их эффективности и безопасности. По сравнению с синтетическими препаратами средства из природного сырья содержат, как правило, несколько биологически активных веществ, которые определяют основное фармакологическое действие, обладая при этом широким спектром фармакологических эффектов.

Основой изучения лекарственных средств из природного сырья являются стандартные операционные процедуры, соответствующие принципам Good Laboratory Practice (GLP), использование при этом в качестве стандарта уже зарегистрированного препарата из той же фармакологической группы в аналогичной лекарственной форме позволяет отбирать новые лекарственные средства природного происхождения, не уступающие по эффективности и безопасности уже разрешенным для медицинского применения [11].

В настоящее время доклиническое изучение нового лекарственного средства природного происхождения включает проведение фармакологических исследований, объем которых, помимо прочего, определяется видом заявляемой специфической активности.

Качественное и всестороннее изучение лекарственных средств, разрабатываемых из природного сырья, позволит значительно повысить качество новых лекарственных препаратов природного происхождения и гарантировать их фармакологическую активность и безопасность [11].

579

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

Целью настоящего исследования явилось установление степени ранозаживляющего действия линимента «Арнилек», геля «Арнилек» и крема «Арнилек» у экспериментальных животных.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1.Оценить влияние препаратов арники на процесс заживления механической травмы кожных покровов;

2.Оценить влияние препаратов арники на процесс заживления термической травмы кожных покровов;

3.Оценить влияние препаратов арники на процесс заживления лучевого поражения кожных покровов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Актуальной проблемой современной медицины является лечение

раневых процессов. Независимо от этиологии они характеризуются наличием болевого синдрома, патогенной микрофлоры, гнойного экссудата, избыточной гидратации и т.д.[10].

К настоящему времени для терапии ран, ожогов и трофических язв предложено большое количество (более 1000) препаратов и методов лечения

[12, 13].

Создание лекарственных форм для наружного применения, сочетающих в своем составе активные субстанции и вспомогательные вещества, направленно действующие на раневой процесс, является актуальной задачей, в решении которой одно из главных мест занимает местное лечение с использованием мазей, гелей и линиментов. Расширение познаний о закономерностях заживления язв привело к тому, что их лечение стали проводить дифференцированно в зависимости от глубины поражения, стадии раневого процесса, локализации поражения и от ряда других факторов [10, 11].

580

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

Конечной целью процесса ранозаживления является восстановление внешнего дефекта кожи. Процесс ранозаживления начинается с фазы экссудации, которую впоследствии сменяют фазы пролиферации и репарации. Экссудативная фаза: продолжительность данной фазы составляет 2-3 дня. Повреждение сосудов в области раны нарушает нормальный путь поступления питательных веществ, вследствие чего активизируются процессы анаэробного гликолиза. Нарастающий ацидоз также способствует перемещению клеток воспаления и макрофагов из интактных капилляров в область раны. Отторжение разрушенных тканей, очистка раны осуществляются под действием фагоцитов и лизосомальных ферментов, а фибриноген, представленный в ране, полимеризуется в фибриновые нити и формирует струп [13].

Фаза пролиферации: с началом этой фазы кровеносные капилляры начинают активно прорастать в область поражения. Фибробласты мигрируют из соседних здоровых тканей и синтезируют из коллагена и других соединительнотканных волокон высоковаскуляризированную грануляционную ткань. Нити фибрина с этого момента начинают рассасываться.

Репаративная фаза: в процессе рубцевания раны грануляционная ткань замещается пучками коллагеновых и других соединительнотканных волокон, параллельный ход которых обеспечивает стягивание их краев и начало формирования рубцовой ткани. Эпителизация происходит путем миграции эпителиальных клеток из краев раны с последующим утолщением эпителиального слоя за счет митотического деления [13].

Среди большого количества различных способов лечения ран и ожогов до сих пор продолжается поиск оптимальных методов стимуляции заживления обширных ран, ожогов, трофических язв. Местное консервативное лечение занимает большой удельный вес в комплексной терапии поражений кожи и чрезвычайно важно для быстрейшего заживления ран [10, 12].

581

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

Актуальность вопроса состоит и в том, что практическое здравоохранение не обеспечено в полной мере эффективными биостимулирующими препаратами, а применяемые средства имеют ряд серьезных побочных эффектов, для их синтеза и приготовления часто необходимо зарубежное сырье. Следовательно, поиск препаратов, синтезированных или полученных из отечественного сырья, обладающих многокомпонентностью действия и лишенных побочных эффектов, имеет большое практическое значение. Основой для создания средств удовлетворяющих данным требованиям, могут стать препараты на основе арники.

Упоминания об использовании арники, называемой тогда Panacea lapsorium, относятся к началу XVIII в. Многие европейские врачи применяли арнику как антисептик и тонизирующее средство при интермиттирующих лихорадках, септицемии, лечении ссадин, гематом и т.д. В настоящее время в аллопатии арника необоснованно забыта и почти не применяется, хотя обладает иммуностимулирующим, антисептическим, противовоспалительным, кровоостанавливающим действием, при этом как гомеопатический препарат широко известна, и, по разным оценкам, на её долю приходится основное количество продаж среди монопрепаратов в различных лекарственных формах.

Для приготовления лекарств используют высушенные цветы Arnica montana. В соцветиях арники содержатся арницин, эфирное масло, дубильные вещества, цинарин, холин, бетаин, стерины, жирное масло, витамин С, сахар, органические кислоты, макроэлементы, микроэлементы и другие вещества.

Настой из цветков арники может назначаться наружно в виде влажных повязок, примочек или компрессов при ушибах, ссадинах, гематомах, а также при различных гнойничковых заболеваниях кожи, трофических язвах, легких ожогах и отморожениях. В современной фитотерапии принято использовать тинктуру цветов арники местно при ушибах, растяжениях, артритах, флебитах, мышечной боли, болезненности молочных желез, травмах, укусах насекомых, акне, фурункулезе, абсцессах [3, 4, 6, 9].

582

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

Как показали экспериментальные исследования [7, 8], экстракт арники является малотоксичным веществом, а мазь, гель и линимент «Арнилек» созданные на его основе, не обладают местно-раздражающим и кожносенсибилизирующим свойствами. При длительном введении внутрь и накожных аппликациях препараты хорошо переносятся и не оказывают отрицательного влияния на организм животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучение влияния препаратов на процесс заживления механической,

термической и лучевой травмы кожных покровов проводилось на белых крысах с исходной массой 200 - 240 г обоего пола, приобретенных в питомнике «Рапполово» АМН РФ. Животных содержали в виварии при температуре воздуха 20о-22оС, естественном освещении, на подстилках из опилок деревьев лиственных пород. Рацион животных соответствовал Приказу МЗ №1179 от 1983 г. Кормление осуществлялось ad libitum, в первой половине дня при свободном доступе к воде. Для маркировки животных применяли спиртовой раствор пикриновой кислоты [5]. Для исследования применялись здоровые животные с чистыми кожными покровами, прошедшие карантин в течение 14 суток. За 1-2 дня до эксперимента кожу животных освобождали от шерсти с помощью ножниц. Поверхность освобожденного от шерсти участка кожи составляла приблизительно 2,5x2,5 см, что составляет около 5 % от общей поверхности кожи животных.

Экспериментальную оценку ранозаживляющего действия геля, крема и линимента «Арнилек» проводили на моделях повреждений кожи у лабораторных животных методом простого скрининга. Сопоставимость экспериментальных групп обеспечивали рандомизацией выборок, использовавшихся в экспериментах.

В исследовании ранозаживляющего действия использовались: крем «Арнилек», гель «Арнилек», линимент «Арнилек», мазь «Левомиколь».

583

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

Линимент «Арнилек» представляет собой тягучую, гомогенную массу цвета «кофе с молоком» с выраженным ароматным специфическим запахом. Состав линимента «Арнилек»:

1.Экстракт арники – 5 г.

2.Ареспол (редкосшитый полимер) – 2 г.

3.3-этаноламин – 2мл.

4.Твин-80 – 1 г.

5.Масло касторовое - 10 г.

6.Нипагин – 0,1 г.

7.Вода очищенная – до 100 г.

Гель «Арнилек» представляет собой гелеобразную, прозрачную

гомогенную массу коричневого цвета с приятным специфическим запахом, хорошо впитывающийся при накожной аппликации.

Состав геля «Арнилек»:

1.Экстракт арники – 5 г.

2.Ареспол (редкосшитый полимер) – 2 г.

3.3-этаноламин – 2мл.

4.Твин-80 – 1 г.

5.Нипагин – 0,1 г.

6.Вода очищенная – до 100 г.

Крем «Арнилек» представляет собой мазеподобную гомогенную массу

коричневого цвета со специфическим запахом. Состав крема «Арнилек»:

1.Экстракт арники – 5 г.

2.Марс (редкосшитый полимер) – 3 г.

3.Воск эмульсионный – 6 г.

4.Пеногаситель – 3 г.

5.Масло вазелиновое - 10 г.

6.Нипагин – 0,1 г.

584

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

7.Глицерин – 8 г.

8.Вода очищенная – до 100 г.

Препаратом контроля служила мазь «Левомеколь» производства Нижфарм, Россия.

Хранение препаратов осуществлялось в темном, сухом месте при температуре 50С.

Дефекты кожи оставались открытыми на протяжении всего периода наблюдений. Препараты наносили на поврежденный участок кожи сразу после воздействия и наносили ежедневно в первой половине дня (один раз в сутки) до заживления.

Нанесение механической, термической и лучевой травм кожных покровов, взятие биологического материала от экспериментальных животных проводили в соответствии с существующими требованиями проведения экспериментов на животных [2, 5, 11].

Терапевтическую эффективность препаратов арники изучали in vivo на моделях полнослойной раны, термического и лучевого ожога у крыс.

Для моделирования раны на депилированном участке кожи спины под тиопенталовым наркозом удаляли кожный лоскут, предварительно обозначенный с помощью специального шаблона (D=2 см).

Термический ожог моделировали у предварительно наркотизированных тиопенталом натрия животных контактным способом, с поражением 4-5% поверхности тела с помощью металлического стержня с площадью контактной поверхности 225 мм2 и постоянной температурой накаливания 200°С при времени экспозиции – 10 сек. В результате воздействия формировался ожог IIIб-IV степени.

Лучевые ожоги моделировали облучением кожи спины животных от закрытого контактного источника бета - излучения СU-2 с радионуклидом 90Sr – 90Y. Радионуклид 90Sr является источником мягкого бета - излучения (Еmax = 0,544 МэВ, Еср = 0,22 МэВ) без сопутствующего гамма-излучения. Дочерний

585

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

продукт 90Sr – 90Y – жесткого излучения (Емах= 2,25 МэВ, Еср = 0,93 МэВ). Доза облучения кожи составляла 30 Гр при мощности дозы на поверхности кожи 2,0 Гр/мин, под кожей – 0,6 Гр/мин. Поле облучения кожи – 1,5х1,5 см2. Глубина повреждения кожи соответствовала при облучении кожи в дозе 30 Гр - III-а степени клинической классификации [1].

Уживотных перед воздействием, непосредственно после воздействия и в течение эксперимента, кроме оценки местного действия препаратов проводилось исследование общего состояния животных (цвет кожи и слизистых, слюнотечение и выделения из носа, наличие кровоизлияний, поведение животных, агрессия, адинамия, активность, самоподдержание, тремор, гиперкинезы и судороги, парезы и параличи), при этом, проводилась оценка динамики изменения массы тела животных и определение физиологических показателей (объем потребляемой воды и количество съеденной пищи) [2].

Уживотных на протяжении всего периода наблюдения измеряли величину раневой и ожоговой поверхности. Выявление ранозаживляющего действия препаратов у животных включало проведение макро- и микроскопическое описание изменений кожи.

Оценку ранозаживляющего действия исследуемых препаратов проводили по визуальным признакам развития поражения, течению раневого процесса и выживаемости животных. Ежедневно оценивали внешний вид ран, наличие и характер отделяемого, наличие и вид грануляций, отмечали сроки заживления ран.

Оценивали визуальные признаки формирования (деструктивная фаза) и заживления (репаративная фаза) локальных поражений кожи. В деструктивную фазу отмечали сроки появления эритемы и формирования струпа для лучевых ожогов, определяли продолжительность периода экссудации. В репаративную фазу регистрировали сроки отслоения струпа (полного заживления) и определяли продолжительность периода заживления. С целью определения динамики

586

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

заживления поражений кожи проводили измерение площади раневой поверхности и определяли скорость заживления по формуле Л.Н. Поповой.

Для морфологического исследования у крыс под тиопенталовым наркозом (доза тиопентала-натрия составляла 100 мг/кг) проводилось хирургическое выделение изучаемого участка кожи. Изучению подвергался кожно-мышечный лоскут раны от крыс различных групп, взятый на 15-е и 21-е сутки течения раневого процесса. Биоптаты фиксировали в течение 24 часов в 10% растворе формалина, затем их обезжиривали и обезвоживали в спиртах нарастающей концентрации, заливали в парафин и изготавливали гистологические препараты с толщиной срезов 3-5 мкм. Для этих целей применялись стандартное оборудование и реактивы для парафиновой проводки, препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологическое и морфометрическое исследования проводилось при помощи светооптического микроскопа Leica DLMS2 при увеличении 100 и 200. Морфометрия осуществлялась при помощи окуляр-микрометра «Reichert».

Динамика раневого процесса была оценена на 15-е и 21-е сутки, для чего была оценена длина «клина» регенерирующего эпителия в ране, площадь воспалительных изменений, которая включала воспалительный инфильтрат, наличие грануляционной и соединительной (фиброзной) ткани, а также степень выраженности инфильтрации лимфоцитами, гистиоцитами и лейкоцитами (выраженная – 3 балла, умеренно выраженная – 2 балла, слабо выраженная -1 балл).

Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры

Leica DC320.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 5,5. В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стъюдента.

587

WWW.MEDLINE.RU ТОМ8, ФАРМАКОЛОГИЯ, ОКТЯБРЬ 2007

Дата поступления 18.10.2007

Математическую обработку полученных морфологических данных проводили методами вариационной статистики с определением показателей: среднего значения (М), стандартного отклонения (σ), ошибки среднего (m), достоверности различий между группами сравнения с вычислением критерия Стьюдента (t) и уровня значимости (α), доверительного интервала (р), различия считали достоверными при р<0,05.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ В результате проведенных экспериментов на модели кожной раны

установлено, что у контрольных крыс только на 12-15 сутки после начала эксперимента начиналось образование грануляционной ткани, которая постепенно заполняла раневой дефект. К 18-21 суткам регенерация эпителия была умеренно выраженная, при этом воспаление в дерме оставалось выраженным, окончательное заживление происходило на 24-25 сутки.

Раны в этой группе крыс были обширнее. Многослойный плоский эпителий и дерма на 15-е сутки у крыс имели типичное гистологическое строение вне раневого дефекта. Раны у крыс с дефектом эпидермиса, который был покрыт струпом, состоявшим из фибрина с выраженной лимфолейкоцитарной инфильтрацией. Длина «наползавшего» регенерирующего эпителия с проявлениями воспалительной псевдоэпителиоматозной гиперплазии в ране от края нормального эпителия составляла от 3,10 до 3,70 мм, что выражало более выраженные регенераторные потенции. Эпителизации раневого дефекта в этой группе не обнаружено. В дерме имелись проявления фиброза, присутствовала созревающая грануляционная ткань, лимфогистиоцитарная инфильтрация была умеренно выраженной и выраженной, лейкоцитарная инфильтрация и отек были слабо выраженными (рисунок 1).

Заживление полнослойной раны было достоверно (р<0,05) более интенсивным в группах животных, получавших мазь «Левомеколь», гель и линемент «Арнилек».

588