Биомедицина практика

Львиная доля новых разработок в биоинформатике относится к применению реализованного на ЭВМ программного обеспечения (в том числе протоколов), предназначенного для сбора и (или) обработки биологических данных. Эти изобретения подпадают под общую категорию изобретений в области ЭВМ и подразделяются на изобретения, реализованные на ЭВМ, и изобретения, использующие машиночитаемые носители информации. Все эти изобретения имеют две составляющие: а) программное обеспечение и б) аппаратные средства ЭВМ.

Например, основанная на критерии подобия автоматизированная система распознавания новых групп последовательностей нуклеотидов в заданном наборе нуклеотидных последовательностей может включать в себя устройство ввода, память и процессор (в качестве аппаратных компонентов системы), а также набор данных или метод использования команд, хранимых в памяти и выполняемых процессором, – как программное обеспечение системы.

Разработка новых баз данных

Биоинформатика анализирует факты, полученные экспериментальной биологией.

Исходная информация рождается в тысячах экспериментов, независимо проводимых по всему миру с разными целями. Полученные данные экспериментатор сравнивает со всем набором уже имеющихся в банке (рис. 14).

Эти банки содержат первичную, зачастую грязную, информацию. Далее эта информация перерабатывается, в том числе с привлечением научной литературы. В результате возникают литературные, курируемые и вторичные банки данных. Информация в них, как правило, заслуживает большего доверия. Однако, создание новых курируемых банков данных – весьма трудоемкая работа.

Например, определив в опыте нуклеотидную последовательность нового гена с неизвестной функцией, исследователь может узнать, имеются ли у других организмов похожие гены и какую функцию они выполняют? Может оказаться, что ген человека, связанный с каким-либо заболеванием, похож, например, на бактериальный ген с известной функцией. Это даст нить для дальнейших исследований по определению роли гена в заболевании.

Если исследователь не нашел в банке открытой им последовательности, он посылает ее туда, пополняя банк. Существуют хранилища любой информации и аннотированной, т.е. отобранной экспертами информации. В функции банков включается хранение, систематизация, обновление информации и обеспечение доступа к ней. Это требует огромных компьютерных мощностей. Кроме того, появилась высокопрофессиональная когорта экспертов. Для сохранения информации банки данных созданы в США, Европе, Японии, они в значительной степени дублируют друг друга, но это позволяет не потерять накапливаемую человечеством информацию в случае форс-мажорных обстоятельств.

61

63

Рис. 15. Разнообразные банки данных: 1 – хранят нуклеотидные последовательности генов, 2 – аминокислотные последовательности белков, 3 – метаболические карты передачи сигналов либо взаимного превращения веществ в клетке, 4 – содержат данные о трехмерном строении молекул, 5 – генетические карты хромосом

Открытие лекарственных препаратов и фармакоинформатика

Лекарственный препарат – химическое вещество, молекула которого взаимодействует с мишенью (биологической молекулой) внутри организма и посредством такого взаимодействия вызывает тот или иной физиологический эффект. Молекулярные мишени обычно относятся к белкам. В зависимости от производимого ими эффекта, лекарства могут оказывать благотворное или вредное влияние на организм. Цель фармацевтической промышленности состоит в разработке медикаментов, обладающих определенными целебными эффектами и предназначенных для излечения многих заболеваний, особенно болезней человека.

Лекарственным препаратом можно назвать только такое химическое соединение, которое отвечает следующим требованиям: оно должно быть безопасным, эффективным, устойчивым (и химически, и метаболически), легко усвояемым (должно быстро всасываться и переноситься к участку воздействия), фармацевтически доступным (путем выделения из естественных источников или химического синтеза) и оригинальным (патентоспособным).

Открытие лекарственных препаратов

Разработку новых медикаментов можно проводить двумя методами: эмпирическим и рациональным. Эмпирический метод – это слепой метод проб и ошибок; его называют также методом черного ящика. Тысячи химических соединений испытывают на патогенах или опытных организмах, даже не зная мишень, на которую препарат воздействует, и механизм его действия. Впрочем, иногда может произойти случайное открытие, подобное открытию пенициллина.

Обычно на медикаментозную активность проверяют тысячи химических соединений. Как правило, лишь одно из 10 000 может действительно поразить мишень. В подобного рода подходах никто не знает заранее, какую мишень препарат атакует и каков сам принцип воздействия. Рациональный подход начинается с ясного знания мишени и механизма, приводящего к ее поражению. Открытие лекарственных препаратов включает в себя задачи обнаружения мишени и поиска снаряда. Мишень относится к причинному фактору болезни, а снаряд – к активной молекуле, которая взаимодействует с этим причинным фактором.

При медикаментозном лечении болезни лекарства взаимодействуют с мишенями, которые так или иначе способствуют развитию болезни, влияют на их активность и таким образом производят различные положительные эффекты. Терапевтическая мишень может быть эндогенной (белок, синтезируемый в организме пациента, которому назначен препарат) или, в случае инфекционных заболеваний, – экзогенной (белок, производимый болезнетворным организмом). Медикаменты либо стимулируют, либо подавляют активность белка-мишени.

64

Опознавание и утверждение мишени

На самом деле разработка препарата оказывается не столь легкой задачей. Это невероятно сложный, продолжительный и дорогостоящий процесс. Получение препарата начинается с установления потенциально подходящей мишени болезни. Этот процесс называют опознаванием мишени. Здесь нужно изучить все, что известно о самой болезни, о возможных причинах заболевания, ее симптомах, генетике, эпидемиологии, связи с другими болезнями – человека и животных – и, наконец, обо всех известных методах ее лечения.

Прежде всего, должна быть выяснена причина заболевания, распространение болезни в популяции, развитие болезни в организме пациента, биохимические и физиологические изменения, наблюдаемые у пациентов, и т. д. В прошлом опознавание мишени проводили в основном ввиду медицинской целесообразности. Теперь опознавание мишени зависит не только от медицинской потребности, но и от таких факторов, как успех существующих методов терапии, деятельность конкурирующих компаний – производителей лекарственных средств, а также от оценки перспектив рынка.

Типы мишеней Мишенями для медикаментозного воздействия обычно являются

биомолекулы, например, ферментов, рецепторов или ионных каналов. Применимость того или иного фермента в качестве мишени зависит от того, насколько он важен для выживания патогена. Если этот фермент оказывается мало существенным, то такая мишень не представляет никакой ценности. Если терапевтическая мишень находится внутри организма, то флуктуации ее активности должны соответствовать колебаниям серьезности (тяжести) заболевания. Только в том случае, когда удается установить высокий уровень значения воздействия на мишень для эффективного контроля над ходом заболевания, мишень может быть признана адекватной данной болезни.

Как только мы удостоверились в правильности выбора мишени, мы можем определить ее модуляторы. Модуляторы мишеней делятся на положительные и отрицательные (табл. 1).

Таблица 1

Список положительных и отрицательных модуляторов

Оценка и утверждение За опознаванием мишени следует процесс ее утверждения. Последний

предполагает всесторонние испытания терапевтического потенциала молекулярной мишени. Этот процесс может включать в себя моделирование бо-

65

лезней на опытных животных и анализ данных об экспрессии генов и белков. Путем сравнения уровней экспрессии генов в нормальном и болезненном состоянии новые медикаментозные мишени могут быть обнаружены in silico. Этим целям могут, служить испытания на микроматрицах.

Как только ген, который в болезненном состоянии обнаруживает «повышающую или понижающую регуляцию» (экспрессируемый на более высоком или низком уровне, чем в нормальной ткани), установлен, определяют его природу с помощью методов биоинформатики. Кроме того, посредством программы «БЛАСТ» проводят поиск подобных ему генов или белков в базах данных последовательностей. Подобные гены и белки помогают определять функцию подверженного регуляции гена. Если оказывается, что мишень принадлежит к одному из классов структур, которые очень легко поддаются медикаментозному воздействию (рецепторы, ферменты или ионные каналы), то создатель препарата может вздохнуть с облегчением.

Адекватная мишень должна обладать высоким терапевтическим показателем, то есть должна быть гарантия существенного терапевтического эффекта при введении такого препарата. Если мишенью является известный белок, то активность к связыванию может быть измерена непосредственно. Потенциальный противомикробный препарат может быть испытан путем наблюдения его воздействия на рост культуры патогенных микроорганизмов. Эффект некоторых соединений можно проверять на эукариотических клетках, выращенных в культуре тканей. Если какое-либо лабораторное животное восприимчиво к данной болезни, то испытания медикамента могут быть проведены на группе опытных животных.

Признаки Если найденная мишень является ферментом, то изучают следующие

признаки: активный центр и участвующие в его формировании аминокислоты, наличие или отсутствие кофактора, число водородных доноров и акцепторов, находящихся в активном центре, топология активного центра.

Если мишень оказывается биохимическим веществом или субстратом какого-либо фермента, то проводят оценку следующих факторов: размер молекулы, ее химическая природа, наличие групп, показывающих донорную или акцепторную емкость (по отношению к водороду), побочные продукты метаболизма и возможности химической модификации этого соединения.

Определение опытного соединения

После окончательного утверждения мишени начинается поиск лекарств, которые взаимодействуют с этой мишенью. Этот процесс называется созданием снаряда и состоит в поиске опытных соединений, то есть веществ, обладающих частью желательной биологической активности идеального лекарственного препарата.

66

Качества снаряда Молекула-снаряд должна иметь следующие желательные качества:

а) потенцию (способность эффективно модулировать мишень), б) растворимость (она должна быть легко растворима в воде для более

быстрого эффекта), в) умеренную липофильность (способность проникать через плазма-

тическую мембрану), г) метаболическую устойчивость (не должна слишком быстро разру-

шаться в организме; желателен также длительный срок хранения), д) биологическую усвояемость (быстрое всасывание в организме и в

то же время медленное выведение для поддержания активности), е) специфичное связывание белков, ж) слабую или нулевую токсичность.

Поиск опытных соединений Известно несколько стратегий поиска опытных соединений:

1)интуитивная прозорливость – за счет «случайных» наблюдений и опытов (открытие пенициллина Александром Флемингом);

2)изыскание естественных источников – заимствования из различных направлений традиционной медицины (хинин из коры хинного дерева);

3)изучение всей известной информации о субстратах, лигандах или ингибиторах, а также о механизме активности белка-мишени и выбор потенциально активных соединений на основании анализа собранных данных;

4)испытание лекарств, показавших свою эффективность в лечении аналогичных заболеваний;

5)массовые отборочные испытания близких по составу или функции веществ;

6)обзор сведений о побочных эффектах, отмеченных в практике применения существующих лекарств;

7)перебор и проба тысяч соединений «вслепую»;

8)компьютерное моделирование и автоматическое проектирование

ab initio.

Оптимизация опытного соединения

Первичное опытное соединение, найденное одним из вышеприведенных способов, должно быть оптимизировано. Оптимизация заключается в модификации контрольных соединений с целью получения их производных (конкурсных лекарств) с возможно лучшими терапевтическими профилями. Например, высокая доступность препарата предполагает легкое всасывание и быстрый перенос к мишени. В свою очередь это требует метаболической устойчивости лекарства. Для этого необходим надлежащий профиль растворимости – препарат должен достаточно хорошо растворяться в воде (для обеспе-

67

чения всасывания), но его растворимость не должна превышать определенный порог (иначе он будет немедленно выведен из организма); его растворимость в жирах должна быть достаточна для проникновения сквозь мембраны клеток, но недостаточной для его причисления к жировым запасам.

После модификации конкурсные лекарства оценивают по качеству, принимая во внимание такие факторы, как легкость синтеза и приготовления лекарственной формы. Затем оптимальное соединение регистрируют как новый разработанный препарат и направляют на клинические испытания. Это самая длительная и дорогостоящая стадия процесса разработки препарата. Именно по этой причине большая часть проектов останавливается перед этим этапом. Клинические испытания призваны определить уровень безопасности и переносимости препарата при лечении пациентов и определить его метаболический путь в организме.

Стадии испытаний

Испытания лекарственных препаратов проводят в несколько стадий. Доклиническая стадия: Испытания на опытных животных.

Стадия 1. Нормальные (здоровые) добровольцы.

Стадия 2. Оценка безопасности и эффективности воздействия на пациентов, выбор дозы и режима приема.

Стадия 3. Сравнение эффекта в группах пациентов, принимающих новый препарат и плацебо, или компаратор; на этой стадии ожидают апробацию от соответствующих регулятивных органов и принимают решение о выпуске лекарства в продажу.

Стадия 4. Длительное отслеживание побочных реакций, о которых сообщают фармацевты и доктора.

Вклад различных научных направлений в развитие методики разработки лекарственных препаратов.

В развитие методики разработки лекарственных препаратов неоценимый вклад внесли геномика, протеомика, комбинаторная химия и технология высокопроизводительных отборочных испытаний. Геномика и протеомика коренным образом изменили подход к опознаванию и утверждению молекулярных мишеней. Традиционно мишени для медикаментозного воздействия оценивались путем наблюдений над пациентами и подбора опытных соединений, дающих желательный клинический эффект.

С появлением геномики и, в частности, полной последовательности генома человека и ее функционального анализа, тысячи новых потенциальных мишеней могут быть опознаны по последовательности, структуре и функции.

Для построения алгоритмов для моделирования взаимодействий бел- ка-мишени с молекулами препарата важна биоинформатика. Благодаря это-

68

му стала возможной именно рациональная разработка препаратов, где на основании данных о структуре белка предсказывают тип лигандов, взаимодействующих с данной мишенью, и таким образом прокладывают путь к открытию снаряда.

В последнее время для опознавания опытных соединений начали применять систематические методы. Эти методы основаны на высокопроизводительных отборочных испытаниях, в которых открытие снарядов ускорено за счет высокопараллельных форм для анализа (например 96-луночных планшетов). В свою очередь внедрение таких технологий требует собрания больших химических библиотек для проведения испытаний. Это стало возможным благодаря методам комбинаторной химии, посредством которых большое число различных соединений может быть синтезировано путем объединения и разделения реагентов между очередными стадиями реакции.

Программы поиска

Прежде чем проводить отсеивающие эксперименты в лабораторных условиях, имеет смысл попытаться собрать как можно больше информации о потенциальных взаимодействиях препарата с мишенью.

Одним из путей получения таких данных является автоматический отборочный поиск в химических базах данных (на соответствие молекулярной мишени с известной структурой). В других случаях структуру соединения можно попытаться определить по подобию с установленной структурой близкой гомологии или предсказать ее с помощью алгоритма протягивания. Если структура белка-мишени известна, то можно применять основанные на критерии адекватности алгоритмы распознавания потенциальных взаимодействующих лигандов.

Таблица 2

Программное обеспечение имитационного моделирования стыковки, предназначенное для загрузки на ПК

или диалоговой работы в «Интернете»

69

Примечание. Ж означает «жесткий»; Г означает «гибкий»; эти буквы показывают, что программа оценивает лиганд в качестве жесткой (Ж) или гибкой (Г) молекулы.

К настоящему времени разработано большое число алгоритмов стыковки, которые пытаются подобрать маленькие молекулы к участкам связывания, анализируя информацию о пространственных ограничениях и энергии связей (табл. 2).

Стыковочные алгоритмы К наиболее общепризнанным алгоритмам (программам) стыковки мож-

но отнести «Автодок» (Autodock), «ДОК» (DOCK) и «КомбиДОК» (CombiDOCK). В «ДОКе» расположение атомов на участке связывания преобразуется в упорядоченное множество шаров, называемых точками участка. По расстояниям между шарами алгоритм рассчитывает точные размеры участка связывания; вычисленные размеры сопоставляются с информацией из базы данных химических соединений. Найденным соответствиям между участком свя-

70