uchebnik_Mikrobiologia_pischevykh_proizvodstv_1

Рис 27. .Транспорт веществ через цитоплазматическую мембрану:

а - цитоплазма: б - мембрана; в- окружающая среда: р – переносчик

Активный транспорт веществ идет против градиента концентрации, т.е. от меньшей концентрации к большей, что обязательно сопровождается затратой энергии.

Попав внутрь клетки, вещество освобождается от переносчика также с затратой энергии.

При активном транспорте скорость поступления вещества в клетку достигает максимума

уже при малой концентрации его в питательной среде, причем концентрация этого вещества в клетке может значительно превысить его концентрацию в питательной среде.

Прокариоты и эукариоты различаются по механизмам транспорта - у прокариот избирательное поступление питательных веществ происходит путем активного транспорта, у эукариот - путем облегченной диффузии. Вывод продуктов обмена из клеток микроорганизмов чаще всего осуществляется путем облегченной диффузии.

Энергетический обмен

Для переноса питательных веществ через ЦПМ и синтеза из них основных компонентов клетки, размножения, движения, микроорганизмам необходима энергия,

поэтому отдельные химические реакции, обусловливающие построение веществ тела микроорганизмов (биосинтез), должны быть сопряжены с реакциями, в результате кото-

рых выделяется энергия.

Совокупность окислительно-восстановительных реакций, протекающих в клетке,

за счет которых клетка получает энергию, называется энергетическим обменом.

Способ получения энергии микроорганизмом зависит от набора окислительно-

восстановительных ферментов, входящих в состав его клетки.

Все способы получения энергии в основном сводятся к окислению молекул восстановленных веществ и восстановлению молекул окисленных веществ. Эти реакции объединены под названием биологическое окисление.

Энергетические процессы по своему объему значительно превосходят конструктивные. Микроорганизмы могут использовать энергию видимого света

(фототрофы) и химическую энергию, высвобождающуюся при окислении различных восстановленных соединений (хемотрофы). В зависимости от способа получения энергии и используемого источника углерода все микроорганизмы делятся на фото- и

хемоавтотрофы, фото- и хемогетеротофы .

Способы получения энергии хемогетеротрофами лежат в основе важнейших биохимических процессов, используемых в пищевых производствах или лежащих в основе порчи сырья, полуфабрикатов и готовой продукции пищевых производств с помощью микроорганизмов. В качестве источников энергии они могут использовать широкий круг органических веществ, чаще углеводы, а также спирты (одноатомный -

этиловый спирт, трехатомный - глицерин; шестиатомные спирты - сорбит, маннит и др.),

аминокислоты, пурины, пиримидины, жиры, органические кислоты и др.

Хемогетеротрофы могут получать энергию полным окислением (дыханием), неполным окислением, брожением, анаэробным дыханием.

Контрольные вопросы

1.Каков химический состав микроорганизмов?

2.Каков механизм поступления питательных веществ в микробную клетку? 3.Какие вещества необходимы для питания микроорганизмов?

4.В чем сущность автотрофного и гетеротрофного питания у микроорганизмов? 5.Какие виды энергии могут использовать микроорганизмы?

6.В чем разница между аэробами, строгими и факультативными анаэробами? 7.Что такое полное и неполное окисление субстрата?

8. Каково значение ферментов в процессах питания и дыхания микроорганизмов? 9.Какую роль играют факторы роста в жизни микроорганизмов?

10.Назовите способы получения энергии хемогетеротрофами?

Культивирование и рост микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов в микро-

биологии. Оно основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для жизнедеятельности микроорганизмов.

Культивированием называют выращивание микроорганизмов на питательных средах в определенных условиях, а развивающийся при этом организм - культурой.

Культивирование при определенной температуре называется инкубированием ( или инкубацией).

Строго говоря, рост - это физиологический процесс, в ходе которого увеличиваются размеры и масса одной популяции. В результате размножения увеличивается число особей. Чистой называется культура, представляющая собой потомство одной клетки. В

природе встречаются гетерогенные культуры, а в пищевых производствах, основанных на использовании биохимической деятельности микроорганизмов, применяют в основном чистые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых бактерий и др. В последнее время в ряде производств находят успешное применение двух-, трехкомпонентные чистые культуры, состоящие из двух, трех видов микроорганизмов.

Для изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств любого микроорганизма из окружающей среды проводят его выделение в чистую культуру. Это дает возможность провести идентификацию микроорганизма и установить его таксономическое положение.

Выделение производят путем изолирования одной клетки микроорганизма одним из специальных приемов, затем осуществляют ее размножение на подобранной для данного микроорганизма питательной среде, создав элективные (избирательные) условия.

Элективные условия обеспечивают преимущественное развитие выделяемой культуры и ограничивают развитие соответствующих микроорганизмов. Указанные условия можно создать путем использования элективных сред. Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (почвы, воды, воздуха), в

которой данный микроорганизм находится в небольшом количестве, получают

накопительные культуры в элективных условиях. Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала в питательную среду для получения чистой или накопительной культур называют посевом. Перенесение выращенных клеток из одной

среды в другую стерильную среду называется пересевом.

Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток одного вида микроорганизма, так как элективные среды в сочетании с элективными условиями

ограничивают развитие сопутствующих микроорганизмов.

После получения накопительной культуры приступают к выделению чистой

культуры. Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов до

настоящего времени является метод, предложенный Р.Кохом. Разбавленную суспензию клеток накопительной культуры высевают на плотную среду с целью получения из каждой клетки отдельной колонии. Выросшая колония обычно состоит из клеток,

развившихся от одной клетки, и является чистой.

Чистые культуры сохраняют в пробирках на плотной среде, периодически пересеивая их на свежие питательные среды. Другими способами хранения чистых культур микроорганизмов являются: хранение под слоем вазелинового масла, при низких и ультранизких температурах и в лиофилизированном состоянии.

Метод лиофилизации заключается в высушивании клеток из замороженного состояния под вакуумом, минуя жидкую фазу (по типу сублимации). Основные задачи хранения микроорганизмов - поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес для науки и практики. Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза, то есть к торможению процессов обмена веществ.

Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях, которые хранятся в коллекции музея чистых культур.

Чистые культуры рассылаются научно-исследовательскими отраслевыми институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность.

Разведение чистой культуры осуществляют путем посева микроорганизмов из коллекционной культуры в стерильную питательную среду и включает несколько последовательных пересевов в постепенно возрастающие объемы питательной среды.

Для культивирования микроорганизмов применяют питательные среды, которые должны содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Культивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным,

периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях.

Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита

(спирта, кислорода, фермента и т.д.).

При периодическом способе культивирования чистая культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства:

Первая стадия - лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду.

Вторая стадия - фаза логарифмического роста(экспоненциальная)

характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена.

Рис. 28. Закономерность роста чистой культуры микроорганизма:

а - лаг-фаза; б - логарифмическая фаза; в - стационарная фаза; г- фаза отмирания.

Третья стадия - стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.

Четвертая стадия - фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания).

В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном)

состоянии - на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.

Принципы составления сред для культивирования

микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов применяют питательные среды, которые должны содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных

веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основные типы питательных сред

По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.

Естественными (натуральными) называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, молоко, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов и т.д. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как них трудно учесть потребление ряда компонентов и образования продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов,

накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт.

Синтетические среды - это среды, в которые входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах.

Синтетические среды широко используются при исследовании обмена веществ,

физиологии и биохимии микроорганизмов. Для разработки состава синтетических сред,

обеспечивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез какого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам неопределенного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу.

Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют так называемые

полусинтетические среды. Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония, фосфаты и т.д.

Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят

широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот,

витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические

(индикаторные) среды.

Элективные среды предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они обеспечивают преимущественное развитие определенной

группы микроорганизмов, для которой характерна общность физиологических свойств.

Дифференциально-диагностические среды (индикаторные) дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их

особенности. Примером индикаторной среды для выявления кишечной палочки в

естественных субстратах может служить агарированная среда Эндо. Бактерии из рода

Escherichia на этой среде образуют розовые и малиновые колонии с металлическим

санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные среды.

Жидкие среды широко применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся,

например, разваренное пшено, отруби и др.

Плотные среды используются для выделения чистых культур, в диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекции и в ряде других случаев.

С целью уплотнения сред применяют агар или желатин. Плотной основой могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают питательной средой.

Наиболее часто для уплотнения питательных сред применяют агар, представляющий собой сложный полисахарид, в состав которого входит агароза и агаропектин. Агар получают из водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка.

Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде

он образует гель, который плавится примерно при 1000С и затвердевает при температуре

400С .

Желатин - это экстракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатином гель плавится при температуре 250С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30-370С). Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмов выделяют в среду. Эти свойства желатина ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатин используют главным образом в диагностических целях - для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей.

Плотной основой могут служить пластинки силикагеля, который является веществом неорганической природы.

Примерные темы лабораторных работ

1.Методы культивирования чистых культур микроорганизмов.

2.Техника приготовления питательных сред для культивирования чистых культур микроорганизмов.

3.Подготовка посуды и питательных сред к стерилизации. Методы стерилизации микробиологической посуды и питательных сред.

4.Пересев чистой культуры на плотные и жидкие питательные среды.

5.Методы выделения чистых культур. Описание культуральных и морфологических признаков на плотных средах.

Контрольные вопросы

1.Что такое чистая культура микроорганизмов?

2.Какова закономерность роста чистой культуры микроорганизмов при периодическом культивировании?

3.Что такое культивирование микроорганизмов, и какие Вы знаете методы их культивирования?

4.Какие Вы знаете питательные среды по составу? По физическому состоянию? По назначению?

5.Дайте понятие непрерывного культивирования микроорганизмов?

6.Что такое иммобилизованные клетки микроорганизмов?

Микроорганизмы и окружающая среда

Жизнь микроорганизмов непрерывно связана с окружающей средой. С одной стороны, деятельность микроорганизмов значительно изменяет окружающую среду в результате использования питательных веществ и выделения продуктов обмена; с другой стороны, интенсивность обменных процессов в клетке во многом зависит от условий окружающей среды. Наука о взаимоотношениях живых организмов с окружающей средой называется экологией.

Отдельные свойства среды обитания, воздействующие на микроорганизмы,

называются экологическими факторами. Некоторые из них необходимы клетке, а

некоторые наоборот, вредны - могут приостановить их рост и размножение, а также привести клетки к гибели. Под воздействием экологических факторов возможен и мутагенез, т.е. изменение наследственных свойств клетки.

Экологические факторы весьма многообразны и изменчивы, поэтому микроорганизмы постоянно адаптируются (приспосабливаются) к ним и регулируют свою жизнедеятельность в соответствии с их изменениями. к гибели, могут быть ликвидированы в определенных условиях и тогда способность к росту и размножению восстанавливается. Это явление называется реактивацией микроорганизмов, оно наблюдается, например, после воздействия некоторых видов лучистой энергии и высокой температуры.

Экологические факторы имеют разную природу и специфику действия. Они подразделяются на абиотические (факторы неживой природы), биотические (факторы живой природы), и антропогенные (все формы деятельности человеческого общества,

которые приводят к изменению природы как среды обитания).

По отношению к каждому фактору можно выделить три кардинальные точки. Они определяют не только интенсивность роста микроорганизмов, но и возможность их существования. Минимум – минимальное значение фактора, ниже которого рост не происходит. Максимум - максимальное значение фактора, выше которого рост микроорганизмов практически прекращается. Оптимум - оптимальное значение фактора,

при котором рост микроорганизмов проявляется наиболее интенсивно.