21. Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов.

Для лабораторной диагностики вирусных инфекций используются различные методы.

Вирусологическое исследование (световая микроскопия) позволяет обнаружить характерные вирусные включения, а электронная микроскопия - сами вирионы, и по особенностям их строения диагностировать соответствующую инфекцию (например, ротавирусную).

Для выделения вирусов используют заражение лабораторных животных, куриных эмбрионов или культуры тканей.

Первичную идентификацию выделенного вируса до уровня семейства можно провести с помощью:

• определения типа нуклеиновой кислоты (проба с бромдезоксиуридоном),

• особенностей ее строения (электронная микроскопия),

• размером вириона (фильтрование через мембранные фильтры с порами диаметром 50 и 100 нм),

• наличия суперкапсидной оболочки (проба с эфиром),

• гемагглютининов (реакция гемагглютинации),

• типа симметрии нуклеокапсида (электронная микроскопия).

Существенное значение для идентификации вирусов (до рода, вида, внутри вида) имеет также изучение их антигенного строения, которое проводится в реакции вирусонейтрализации с соответствующими иммунными сыворотками. Сущность этой реакции состоит в том, что после обработки гомологичными антителами вирус утрачивает свою биологическую активность (нейтрализуется) и клетка хозяина развивается так же, как и неинфицированная вирусом. Об этом судят по отсутствию цитопатического действия, цветной пробе, результатам реакции торможения гемагглютинации (РТГА), отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов, выживаемости чувствительных животных.

Методы иммунодиагностики (серодиагностики и иммуноиндикации). Они реализуются в самых разнообразных реакциях иммунитета:

• радиоизотопный иммунный анализ (РИА),

• иммуноферментный анализ (ИФА),

• реакция иммунофлюоресценции (РИФ),

• реакция связывания комплемента (РСК),

• реакция пассивной гемагглютинации (РПГА),

• реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и другие.

При использовании методов серодиагностики обязательным является исследование парных сывороток. При этом четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке в большинстве случаев служит показателем протекающей или свежеперенесенной инфекции. При исследовании одной сыворотки, взятой в острой стадии болезни, диагностическое значение имеет обнаружение антител класса Ig М, свидетельствующее об острой инфекции.

Молекулярно-генетических методов (ДНК-зондирование, полимеразной цепной реакции - ПЦР). В первую очередь с их помощью выявляют персистирующие вирусы, находящиеся в клиническом материале, с трудом обнаруживаемые или не обнаруживаемые другими методами.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей живот­ных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывает­ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен­ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра­няются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Их приготов­ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю­щих способностью длительно размножаться in vitro в определен­ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам­ниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоид­ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе­му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу­емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло­качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опу­холевых.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно вы­сокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздей­ствиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ря­да вирусов используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим из­менениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его обо­лочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность об­наружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очист­ку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препа­ратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность живот­ных к определенному вирусу и их возраст определяют репродук­тивную способность вирусов. Во многих случаях только ново­рожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в воз­можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуциру­ются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся кон­таминация организма подопытных животных посторонними ви­русами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данно­го вируса, что удлиняет сроки исследования.

22. Вирусы бактерий – фаги. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги. Профаг. Лизогения. Фаговая конверсия. Применение фагов в биотехнологии, микробиологии и медицине.

Явление бактериофагии открыл и изучил французский микробио­лог д'Эррель. Д'Эррель назвал этот агент бактериофагом, а само явление лизиса - бактериофагией.

Позже было подтверждено, что бактериофаг - живой. Это вирус бак­терий, он размножается в бактериях, вызывая их лизис. Добавление бак­териофага в культуру бактерий на жидкой питательной среде вызывает просветление среды. На плотных питательных средах при посеве смеси бактерий и бактериофага на фоне сплошного роста бактерий появля­ются стерильные пятна или негативные колонии фагов.

Бактериофаги специфичны, то есть лизируют определенные виды бактерий. Отсюда их названия: дизентерийный бактериофаг, стафи­лококковый бактериофаг. Обнаружены фаги не только бактерий, но и актиномицетов.

В практической медицине бактериофаги нашли применение как лечебные и профилактические средства,

Важное значение имеет то, что на примере бактериофагии были открыты и изучены многие проблемы общей вирусологиии и молекуляр­ной генетики.

Структура бактериофагов

Размеры бактериофагов колеблются от 20 нм до 200 нм. Как все вирусы, содержат ДНК, или РНК, и белковый капсид. Чаще всего встре­чаются и лучше изучены бактериофаги, имеющие форму сперматозои­да или головастика. Состоят они из головки, хвостового отростка, батальной пластинки с короткими шинами и хвостовыми нитями. Внутри головки располагается спи­рально скрученная пить ДНК, по­крытая     белковым     капсидом. Хвостовой отросток - что полый цилиндрический стержень, окру­женный сократительным чехлом. Базальная пластинка и нити осу­ществляют  процесс  адсорбции бактериофага на бактериальной клетке. Существуют бактериофаги, имеющие другое строе­ние: с короткими отростком, с отростком без сократительного чехла, без отростка, нитевидной формы.

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой

Как все вирусы, бактериофаги не размножаются на питательных средах. Их размножение происходит только в чувствительных к ним бактериальных клетках, в процессе взаимодействия, в котором наб­людаются те же фазы, что при взаимодействии других вирусов с клет­кой.

Адсорбция бактериофага. Как все вирусы, фаги неподвижны, и стол­кновение с бактерией происходит случайно, затем адсорбция стано­вится прочной, если у клетки имеются на поверхности фагоспецифические рецепторы. Фаги, имеющие сократительный чехол, ад­сорбируются с помощью хвостового отростка.

Внедрение фага внутрь клетки. Под дей­ствием фермента лизоцима, который находится в хвостовом сегменте, в клеточной стенке бакте­рии образуется отверстие. Через это отверстие в ре­зультате сокращения хво­стового чехла внутрь бак­териальной клетки переходит ДНК фага. Белковый капсид остает­ся снаружи.

Синтез ДНК и белка бактериофага. В клетке прекращается синтез бактериальных белков. Образуются фаговые ДНК, а на рибосомах бактерий синтезируются молекулы фагового белка.

Формирование фага. Сборка зрелых фагов из ДНК и капсида про­исходит в цитоплазме клетки.

Выход зрелых фагов из клетки происхо­дит при разрушении бактерий с помощью лизоцима, а затем зрелые фаги внедряются в новые клетки.

"Урожай" фага, в зависимости от его вида, составляет от 20 до 200 частиц. Весь цикл взаимодействия, занимающий от 10 минут до нескольких часов, называется литическим циклом, а фаг при таком вза­имодействии - вирулентным.

В отличие от вирулентных, умеренные фаги не лизируют бактерии. Их геном, проникнув в клетку, встраивается в хромосому бактерии и в дальнейшем остается в хромосоме в виде профага и реплицируется вме­сте с ней. Бактерии, несущие профаг, называются лизогенными, а само явление - лизогенией. Лизогенные бактерии встречаются очень часто. Профаг, находясь в геноме бактерии, придает ей какие-либо новые свой­ства. Так, например, продукция экзотоксина у палочек дифтерии и бо­тулизма связана с наличием профага.

В определенных условиях (воздействия температуры, химических веществ и др.) профаги могут превратиться в вирулентные бактерио­фаги. Размножаясь, они лизируют бактерии и могут переходить в дру­гие бактериальные клетки. При выходе из хромосомы профаг может захватить соседние гены бактериальной хромосомы и при заражении другой бактерии, встроившись в ее хромосому, передать эти гены. Пе­редача генетического материала от одной бактерии к другой с помо­щью умеренного бактериофага называется трансдукцией. Таким об­разом,  могут передаваться такие признаки, как устойчивость к антиби­отикам, способность продуцировать какие-либо ферменты. Умеренные бактериофаги применяются в генетической инженерии в качестве век­тора - переносчика генов.

Практическое значение бактериофагов

Препараты бактериофагов применяются для диагностики, профи­лактики и лечения. Фагодиагностика основана на специфичности бак­териофагов: видоспецифические бактериофаги лизируют только опре­деленные виды бактерий. Более того, бактерии одного и того же вида различаются по чувствительности к разным типовым бактериофагам, Таким образом можно с помощью набора типовых бактериофагов определять фаговары стафилококков, сальмонелл, вибрионов. Фаготипирование помогает установить источник инфекции и пути передачи.

Лечебно-профилактическое действие фагов основано на их  литической активности.

Для получения препарата бактериофага культуру бактерий зара­жают бактериофагом. На следующий день лизированную культуру фильтруют через бактериальный фильтр. К фильтрату в качестве кон­серванта добавляют хинозол.

В нашей стране выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезного, коли-протейного, стафилококкового и других бакте­риофагов, а также наборы типовых фагов для фаготипирования ста­филококков, брюшнотифозных и других бактерий.

23. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике. Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ. Механизм их антибактериального действия.

Влияние физических факторов.

Влияние температуры. Различные группы микроорга­низмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при вы­сокой — термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится боль­шая группа сапрофитов — обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, све­тящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бакте­рии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при темпера­туре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свой­ства бактерий меняются. Интервал температур, при кото­ром возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум — от 15 до 40 °С, прибли­жаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.

Мезофилы включают основную группу патогенных и услов­но-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развива­ются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при темпе­ратуре 250—300 °С и давлении 262 атм.

Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания на­воза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компос­том. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассмат­ривают как показатель загрязненности почвы.

Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких тем­ператур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном со­стоянии, в том числе при температуре жидкого газа (—173 °С).

Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функ­ций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гоно­реи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.

Высушивание под вакуумом из замороженного состояния — лиофилизацию — используют для продления жизнеспособнос­ти, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные куль­туры микроорганизмов и иммунобиологические препараты дли­тельно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения. Неионизирующее излучение — уль­трафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных ве­ществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предме­тов в больницах, родильных домах, микробиологических лабо­раториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200—450 нм.

Ионизирующее излучение применяют для стерилизации од­норазовой пластиковой микробиологической посуды, питатель­ных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию иони­зирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была вы­делена из ядерного реактора.

Действие химических веществ. Химические вещества могут ока­зывать различное действие на микроорганизмы: служить источ­никами питания; не оказывать какого-либо влияния; стимули­ровать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфи­цирующими. Антимикробные хи­мические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, отно­сятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.

Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли,

Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.

Дезинфекция — процедура, пре­дусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтоже­ния до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании дан­ного предмета. Как правило, при дезинфек­ции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.

Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.

Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.

Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизм их антибактериального действия

1. Спирты, или алкоголи (этанол, изопропанол и др.). Как антисептики, наиболее эффективны в виде 60-70%-ных водных растворов. Спирты денатурируют белки и растворяют липиды. Эффективны в отношении вегетативных форм большинства бактерий, однако споры бактерий и грибов, а также некоторые вирусы к ним устойчивы.

2. Галогены и галогенсодержащие препараты (препараты йода и хлора) широко применяют как дезинфектанты и антисептики. Эти препараты взаимодействуют с гидроксильными группами белков, нарушая их структуру. Препараты хлора и йода являются окислителями. Взаимодействуя с водой, хлор образует хлорноватистую кислоту, которая является сильным окислителем. К хлорсодержащим средствам, используемым для дезинфекции относятся хлорная известь (NaClO), хлорамин Б, хлоргексидина биглюконат (гибитан).

3. Альдегиды алкилируют сульфгидрильные, карбоксильные и аминогруппы белков и других органических соединений, вызывая гибель микроорганизмов. Альдегиды широко применяют как консерванты. Наиболее известные -формальдегид (8%) и глутаральдегид (2-2,5%) – проявляют раздражающее действие (особенно пары), ограничивающее их широкое применение. Растворы формальдегида обладают дезинфицирующим и дезодорирующим эффектами. Их применяют для дезинфекции инструментов. Мыльный раствор формальдегида (лизоформ) применяют для спринцеваний в гинекологической практике, для дезинфекции рук и помещений.

4. Кислоты и щёлочи применяют как антисептики. Среди кислот наиболее известны борная, бензойная, уксусная и салициловая кислоты. Применяют для лечения поражений, вызванных патогенными грибами и бактериями. Наиболее распространена салициловая кислота, применяемая в спиртовых растворах (1-2%), присыпках, мазях, пастах (например, для лечения дерматомикозов); оказывает также в зависимости от концентрации отвлекающее, раздражающее и кератолитическое действие. Из щелочей наиболее распространён раствор аммиака (нашатырный спирт содержит 9,5-10,5% аммиака), применяемый для обработки рук в хирургической практике (0,5% раствор нашатырного спирта). Органические кислоты (бензойная, салициловая, молочная, аскорбиновая, пропионовая) широко применяются в качестве консервантов в пищевой и фармацевтической промышленности.

5. Соли тяжелых металлов связываются с белками и другими органическими соединениями. В качестве антисептиков применяют нитрат серебра (ляпис), сульфат меди (медный купорос) и хромат ртути (мербромин).

6. Фенолы и их замещенные производные денатурируют белки, повреждают клеточные мембраны и нарушают структуруклеточной стенки бактерий (гексахлорофен, резорцин, хлорофен, тимол, салол).

7. Поверхностно-активные вещества включают анионные (мыла) и катионные детергенты. Мыла обеспечивают механическое удаление микроорганизмов с поверхностей кожи и объектов внешней среды. Из катионных детергентов наиболее широко используются четвертично-аммониевые соединения (ЧАС), обладающие антимикробной активностью - они взаимодействуют с фосфолипидами мембран, нарушая их функции. Применяют для дезинфекции и антисептики.

8. Газы. Для уничтожения спор микроорганизмов при стерилизации предметов из пластмасс применяют окиси этилена и пропилена под давлением при 30-60°С. Механизм действия связан со способностью окиси этилена алкилировать белки. В частности, повреждению подвергаются сульфгидрильные группы вегетативных форм бактерий и карбоксильные группы оболочек спор.

9. Красители. В качестве антисептиков давно применяют различные красители (например, бриллиантовый зелёный, метиленовый синий, риванол, основный фуксин). Бриллиантовый зеленый и некоторые другие красители взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, нарушая их функции.

10. Окислители. Механизм антимикробной активности связан с окислением метаболитов и ферментов микроорганизмов, либо денатурацией микробных белков. Наиболеераспространённые окислители, применяемые как антисептики, - перекись водорода и перманганат калия.