Занятие 5 (Активация и торможение ферментативных реакций, номенклатура и классификация ферментных эффекторов)

Цель занятия: ознакомиться с соединениями, контролирующими активность ферментов – т.н. эффекторами; усвоить, что поддержание активности ферментов на определенном уровне – гомеостатический процесс, являющийся результатом противодействующих влияний, и, следовательно, существуют эффекторы, повышающие или снижающие скорость ферментативных реакций, т.е. активаторы или ингибиторы. Ознакомиться с механизмами действия активаторов и ингибиторов.

Студент должен знать следующее:

1. Принципы обнаружения в биологической жидкости активатора или ингибитора ферментативной реакции.

2. Уметь графически представить результаты оценки скорости ферментативной реакции в присутствии активатора или ингибитора

3. Классификацию ферментативных эффекторов, их разделение на подгруппы в зависимости от механизма действия.

4. Особенности и биологическое значение аллостерических эффекторов.

Студент должен уметь:

1. Составить план лабораторного определения рН- и температурного оптимума, зависимости скорости реакции от концентрации субстрата для исследуемого фермента.

2. Анализировать и оценивать графически результаты лабораторного определения рН-зависимости фермента и его зависимости от температуры и от концентрации субстрата.

3. Планировать поиск причины изменения активности фермента, если пред­полагается присутствие в среде ингибитора или активатора.

Студент должен получить представление:

1) о существовании заболеваний, обусловленных дефицитом факторов, являющихся активаторами фер­мен­та (ферментов),

2) о заболеваниях, вызванных появлением в избытке физиологических ингибиторов ферментов,

3) о значении в регуляции обменных процессов аллостерических эффекторов.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

1) сведения об условиях, необходимых для осуществления химической реакции,

2) сведения о механизмах катализа в неживой природе,

3) сведения о существовании гомо- и гетерогенного катализа.

Аудиторная работа. Лабораторная работа (активаторы и ингибиторы ферментативных реакций)

1. Выявление ускоряющего и замедляющего влияния на ферменты.

Хлорид натрия - активатор амилазы слюны, ингибиторы амилазы ионы серебра, соли меди, свинца.

Ход работы. В три пробирки внести по 3 мл слюны, разведенной 1:3 водой. В первую пробирку добавить 2 капли 1%-ного раствора хлорида натрия, во вторую - 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди, в третью - каплю воды (контроль). Затем во все пробирки внести по 5 капель 1%-го раствора крахмала и оставить при 37⁰С на 3 мин, после чего внести во все пробирки по одной капле раствора Люголя и сравнить интенсивность появляющегося синего окрашивания, характерного для крахмала. Выявить (по интенсивности окраски), в какой из пробирок произошел наиболее полный распад крахмала. Напомним, что интенсивность окраски пропорциональна концентрации крахмала.

2. Количественное определение активности амилазы мочи (диастазы). Нормальная активность диастазы в моче здоровых людей невелика - от 4 до 64 ед. (за единицу принимают то её количество, которое за 30 мин при 38⁰С полностью расщепляет 1 мл 0,1%-ного раствора крахмала).

При некротических процессах или воспалительных заболеваниях поджелудочной железы, при воспалении околоушной железы увеличивается активность диастазы в крови, и, как следствие, в моче. Это наблюдение является вспомогательным диагностическим признаком.

Ход работы. В десять пронумерованных пробирок внести по 1 мл 0,14 н раствора хлорида натрия. В одну из пробирок внести 1 мл исследуемой мочи, смешать и затем перенести 1 мл смеси во вторую пробирку, смешать, перенести в третью и т. д. Из последней (десятой) пробирки 1 мл смеси вылить. Во все пробирки внести по 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала и по 1 мл 0,14 н раствора хлорида натрия, смешать, поместить на водяную баню (45⁰С) на 15 мин.

Одновременно и быстро охладить все пробирки, поместив их в холодную воду и добавить в каждую по одной капле раствора Люголя. Жидкость окрашивается в желтоватый цвет йодом, в различные оттенки розового (декстрины) и фиолетового (декстрины с большим размером молекул), а также в синий цвет (крахмал).

Учет результата. Рассчитать количество мочи в последней (слева направо) пробирке, сохранившей желтоватую окраску (полное расщепление крахмала).

Допустим, это пробирка № 4, моча в которой разведена в 16 раз по сравнению с пробиркой 1, где было 0,5 мл мочи. Следовательно, в пробирке 4-й мочи содержится 0,03125 мл (0,5/16). Это количество мочи вызвало расщепление 2 мл 0,1%-го раствора крахмала, а 1 мл мочи способен расщепить х мл, т.е. 0,03125 мл мочи расщепило 2 мл 0,1%-ного раствора крахмала, а 1,0 мочи может расщепить х мл крахмала.

Составляем уравнение и рассчитаем значение величины Х:

Х= = 64 мл 0,1 %-ного раствора крахмала,

следовательно, в моче содержится 64 ед. амилазы на 1 мл мочи

3адание: каждый студент получает результаты анализа двух проб мочи и определяет содержание диастазы в одном мл мочи, выражая в единицах. Результат сопоставить с нормальными значениями.

Выполнить следующее: