Диагностика криптоспоридиоза

Основным методом диагностики криптоспоридиоза является микроскопическое выявление возбудителя. Для этого применяют прижизненные и посмертные методы диагностики.

Прижизненная диагностика криптоспоридиоза молодняка сельскохозяйственных животных основана на выявлении этих паразитов в фекальных массах.

Приготовление препаратов из фекалий. На обезжиренное предметное стекло наносят несколько капель жидких фекалий больных животных (лучше с комочками слизи) и делают тонкий мазок. Препарат хорошо высушивают, после чего фиксируют спирт-эфиром или метанолом в течение 10 мин, высушивают и несколько раз проводят над пламенем спиртовки.

Для увеличения количества криптоспоридий в исследуемом материале можно применять различные методы обогащения. Одним из них является комбинированный метод центрифугирования с использованием флотационных растворов. В качестве последних можно применять растворы нитрата аммония с плотностью 1,3 (1500 г вещества на 1 л воды), серно-кислого цинка с плотностью 1,24 (400 г соли на 1 л воды), нитрата натрия с плотностью 1,38—1,40 (1000 г вещества на 1 л воды), сульфата магния с плотностью 1,26 (920 г соли на 1 л воды) и др.

Пробу фекалий массой 3 г помещают в стаканчик и, постоянно помешивая, приливают 50 мл воды. Взвесь фильтруют в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1,5—2 мин со скоростью 3000 об/мин. После этого надосадочную жидкость сливают, в пробирку наливают один из флотационных растворов, стеклянной палочкой размешивают осадок и повторно центрифугируют. Затем проволочной петлей снимают верхний слой жидкости с центрифужной пробирки, переносят капли на хорошо обезжиренное стекло, предварительно покрытое плазмой или альбумином, и делают мазок. Мазки хорошо высушивают, фиксируют и окрашивают.

Окраска препаратов по Циль-Нильсену. Вначале готовят карболовый фуксин. Для этого берут основного фуксина 2 г, этилового спирта (96°) 12 мл, карболовой кислоты 5 г и дистиллированной воды до 100 мл.

Приготовленную краску наносят на препарат и выдерживают без подогревания 25—30 мин. После этого мазок промывают водой, наносят на препарат 8—10%-ный раствор серной кислоты и выдерживают 40—60 с.

Повторно промывают препарат водой и в течение 3— 5 мин окрашивают его 5%-ным раствором малахитового зеленого в 10%-ном этаноле. Препарат промывают водопроводной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы.

В результате окрашивания ооцисты криптоспоридий диаметром 4—5 мкм имеют ярко-красный цвет, а микрофлора мазка окрашивается в зеленый. Приготовленные и окрашенные по этому способу препараты хорошо сохраняются.

Окраска препаратов по Романовскому-Гимза. На фиксированный препарат наносят 10%-ный раствор краски Романовского-Гимза. Через 30 мин ее смывают водой, препарат высушивают и микроскопируют. При этом ооцисты криптоспоридий окрашиваются слабо. Внутри их иногда можно обнаружить удлиненные и изогнутые спорозоиты, располагающиеся по периферии ооцист.

Окраска препаратов по Кестеру. Готовят раствор сафранина. Для этого к 2 частям насыщенного водного раствора сафранина добавляют 5 частей 5,6%-ного раствора калийной щелочи.

На фиксированный мазок наносят приготовленную краску сафранина. Через 5 мин препарат промывают водой и покрывают на 10 с 0,1%-ным раствором серной кислоты. Препарат повторно промывают водой и докрашивают в течение 12 с 5%-ным раствором малахитового зеленого, промывают водой, высушивают и исследуют при помощи микроскопа с иммерсионной системой.

Метод Вильсона. В центрифужную пробирку набирают 1 мл фекалий, добавляют 2 мл 2,5%-ного раствора бихромата калия и 5 мл раствора сахарозы (1,26 г на 1 мл) в дистиллированной воде. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 800 об/мин. Из верхнего мениска содержимого пробирки петлей снимают несколько капель раствора и переносят их на предметное стекло, покрывают их стеклом и микроскопируют при увеличении X 400. В поле зрения микроскопа—ооцисты крип-тоспоридий светлые на темном фоне остальных структур.

Выявление криптоспоридий с помощью флуоресцентного микроскопа. Мазки фекалий обрабатывают раствором аурамина с карболовой кислотой. После этого их промывают водой и окрашивают в течение 8—10 мин раствором карболового фуксина. Повторно препарат промывают водой, высушивают и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа с иммерсионной системой. При этом обнаруживают ооцисты криптоспоридий в виде ярко флуоресцирующих дисков на темно-красном фоне.

Для посмертной диагностики криптоспоридиоза берут содержимое тощей или подвздошной кишки или делают соскобы со слизистых оболочек их. Материал наносят на обезжиренное стекло, делают мазок, высушивают его, фиксируют и красят по описанным выше методам. Можно также взять 1 г содержимого подвздошной или тощей кишки и исследовать его по описанному выше методу Вильсона.

Диагностика токсоплазмоза

Токсоплазмоз диагностируют с помощью различных методов исследований, включающих эпизоотологические, клинические и лабораторные. Эпизоотологическими исследованиями обнаруживают животных с неясной этиологией заболевания: появление мертворожденных плодов, абортов, всевозможных уродств и т. д. Токсоплазмоз клинически может проявляться в виде параличей, парезов, конъюнктивитов, пневмоний, лихорадки, расстройства работы сердечно-сосудистой системы и органов желудочно-кишечного тракта.

Лабораторные исследования включают в себя микроскопию мазков или гистологических срезов различных органов и тканей: головного мозга, печени, почек, селезенки, легких, лимфатических узлов, сердца. Токсоплазмоз можно обнаружить также в ликворе, плодовых водах, моче, фекалиях.

Для диагностики токсоплазмоза ставят также биопробу на лабораторных животных, проводят иммуносерологическпе и копроскопические исследования фекалий кошек с целью обнаружения ооцист.

Из указанных выше органов не позже чем через 2-3 ч после гибели животных готовят мазки-отпечатки, фиксируют их метиловым спиртом (можно этиловым спиртом или смесью Никифорова) в течение 8-10 мин, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 45 мин. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Наиболее типичной формой внеклеточных токсоплазм является дугообразная или полулунная форма паразита, у которого один конец удлиненный и острый, второй — широкий и округлый. Тканевые токсоплазмы обычно округлой или овальной формы, реже они имеют форму полумесяца. Размеры их достигают 4-7х2-4 мкм.

Из экссудатов, плодовых вод, ликвора и других жидкостей путем центрифугирования (2000 об/мин, 20 мин) можно выделить живых токсоплазм. Их берут из осадка центрифужной пробирки и исследуют в висячей или раздавленной капле под обычным увеличением микроскопа или при помощи иммерсионной системы. Живые токсоплазмы видны при затемненном поле зрения микроскопа, они совершают колебательные, волнообразные или скользящие движения, для чего необходимо поддерживать температуру 37-40 °С.

Выявление ооцист токсоплазм в фекалиях кошек проводится копроскопическим методом с применением центрифугирования и флотационных растворов. Для этого берут 1 г фекалий, помещают в фарфоровую ступку, добавляют 8-10 мл воды, 3 капли 1%-ного раствора карболовой кислоты и хорошо растирают пестиком. Смесь из ступки фильтруют через металлическое или капроновое ситечко в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости 2500 об/мин в течение 10 мин. После этого надосадочную жидкость сливают, к осадку приливают раствор аммиачной селитры с плотностью 1,3 (или другого флотационного раствора с плотностью более 1,15), стеклянной палочкой размешивают осадок с раствором соли и повторно центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 5 мин.

Затем с поверхностного слоя жидкости центрифужной пробирки металлической петлей снимают 5—6 капель, наносят их на обезжиренное предметное стекло и микроскопируют.

Биопроба также является одним из основных методов диагностики токсоплазмоза. Для ее проведения берут навеску в 1 г кусочков головного мозга, печени, селезенки, лимфатических узлов или органов абортированного плода, помещают в стерильную фарфоровую ступку, добавляют туда 3 мл физиологического раствора и тщательно растирают. Полученную суспензию вводят внут-рибрюшинно по 0,5 мл 4—5 белым мышам. При наличии токсоплазм в исходном материале у них через 5—7 дней после введения суспензии появляется тяжелая форма болезни. При этом в брюшной полости мышей образуется до 3 мл транссудата, содержащего большое количество эндозоитов. Для обнаружения токсоплазм берут транссудат из брюшной полости, готовят мазки, из головного мозга делают мазки-отпечатки. Приготовленные препараты фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза, затем просушивают и микроскопируют на наличие эндозоитов с использованием иммерсионной системы, на наличие цист препараты просматривают при увеличении микроскопа 7х20.

Иммуносерологическую диагностику токсоплазмоза проводят с применением токсоплазменного антигена.

Диагностика саркоцистозов

Она проводится на основании эпизоотологических, клинических, серологических и микроскопических исследований, по данным патоморфологических вскрытий.

Компрессорный метод выявления саркоцист. Для этой цели берут пробы мышц различных органов — пищевода, диафрагмы, сердца, скелетных мышц и из каждой пробы по ходу мышечных волокон вырезают по 4 среза величиной с овсяное зерно (И. И. Вершинин, 1982). Срезы помещают на стекло компрессориума, накрывают вторым стеклом и сдавливают с помощью винтов. После этого микроскопируют при увеличении 7х8.

Препараты можно подкрашивать с помощью раствора краски Романовского-Гимза (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 1 ч. После этого препараты обесцвечивают нашатырным спиртом.

Окрашивать препараты можно и по другой методике. Для этого вначале готовят краску: к 30 мл 10%-ного раствора метиленовой сини добавляют 30 мл 0,01%-ного раствора калийной щелочи и полученную смесь разбавляют поровну дистиллированной водой. Полученной краской можно окрашивать препараты в течение 10 мин с последующим обесцвечиванием 25%-ным раствором аммиака (Г. В. Кононенко, 1968).

Метод А. Г. Какурина (1976, 1978) окраски мышечных срезов состоит в том, что автор на препарат предлагает наносить в течение 10 мин 2-3 капли смеси краски, которую готовят из равных частей 0,5%-ного водного раствора метиленовой сини и ледяной уксусной кислоты. После окраски проводят обесцвечивание срезов 25%-ным раствором нашатырного спирта. Препарат промывают водой и микроскопируют. В препарате саркоцисты выглядят в виде темно-синих образований на голубом фоне мышечной ткани. Существуют и другие методы окрашивания срезов для диагностики саркоцист.

Иногда бывает необходимо провести дифференциацию различных видов у одного и того же промежуточного хозяина. Для этого можно применить метод выделения саркоцист по М. Еrbег (1977). Суть его состоит в том, что берут пробу мышц массой 10 г, тщательно измельчают (до 2—3 мм длины), после чего ее помещают в колбу Эрленмейера и приливают туда 50 мл физиологического раствора. Туда же добавляют 8—10 стеклянных бусинок и взбалтывают. Потом суспензию фильтруют через сито с отверстиями диаметром 600—700 мкм в пробирку и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, а осадок пробирки наносят на предметное стекло и микроскопируют при увеличениях Х160 или Х640.

Для обнаружения мерозоитов наиболее удобным является метод М. Коzаr (1971). Берут 2—5 г мышечной ткани, помещают в фарфоровую ступку, добавляют 1— 2 мл физиологического раствора и тщательно растирают. Затем берут каплю полученной суспензии, помещают ее на обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют при затемненном поле. Мерозои-ты видны в виде банановидных образований.

Для выявления трофозоитов саркоцист мышечной ткани О. В. Рыбалтовский (1971) предложил модифицированный метод переваривания мышц в желудочном соке. Для этого 2—3 г мышечной ткани хорошо измельчают, помещают в плоскодонную колбу и заливают 30 мл искусственного желудочного сока (3 г пепсина, 1 мл концентрированной соляной кислоты и 100 мл воды). Колбу помещают в термостат на 1 ч при температуре 38-40 °С. После этого содержимое колбы фильтруют в пробирки и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок помещают на предметные стекла, делают мазки, высушивают их и фиксируют метиловым спиртом. Затем красят 10 мин по Романовскому-Гимза и исследуют под иммерсионной системой микроскопа. Для этих же целей мышцы можно переваривать и трипсином (М. Еrbеr, 1977), а также использовать для выявления мерозоитов метод выдавливания мясного сока (А. А. Богуш, 1976).

Для прижизненной диагностики саркоцистоза плотоядных применяют методы центрифугирования с использованием флотационных растворов.

Для этого берут пробу фекалий массой 3 г, помещают ее в фарфоровую ступку, доливают в нее 25—30 мл воды и пестиком растирают содержимое. Затем полученную взвесь фильтруют в центрифужную пробирку, центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 3—4 мин. После этого осадок сливают, а к осадку добавляют флотационный раствор (с плотностью более 1,2) и повторно центрифугируют при тех же параметрах. Бактериологической петлей с верхней поверхности жидкости в пробирке снимают 5—6 капель, наносят их на обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют при увеличении Х280 и Х630. При этом в препаратах можно обнаружить спорулирован-

Таблица 8. Отличительные особенности саркоспоридий,