Методическое указание для студентов кпрактическому занятию № 42.

Тема занятия: Санитарная микробиология.

Часть 1. Санитарно–микробиологическое исследование воды.

Цель: Освоение практических навыков определения санитарных показателей воды.

Модуль 2. Специальная, клиническая и экологическая микробиология.

Содержательный модуль № 14.

Тема: Санитарная микробиология.

Актуальность темы.. Санитарная микробиология – раздел медицинской микробиологии, изучающий микроорганизмы, содержащиеся в окружающей среде и способные оказывать неблагоприятное воздействие на состояние здоровья человека. Она разрабатывает микробиологические показатели гигиеничекого нормирования, методы контроля за эффективностью обеззараживания объектов окружающей среды, а также выявляет в объектах окружающей среды патогенные, условно-патогенные и санитарно-показательные микроорганизмы. Обнаружение патогенных микроорганизмов позволяет дать оценку эпидемиологической ситуации и принять соответствующие меры по борьбе и профилактике инфекционных заболеваний. Условно–патогенные микроорганизмы способны вызвать гнойно–воспалительные процессы в ослабленном организме. Кроме того, они могут попадать в продукты питания, быстро размножаться с накоплением большого количества микробных клеток и их токсинов, вызывая у людей пищевые отравления микробной этиологии. Санитарно-показательные микроорганизмы (СПМ) используют для косвенного определения возможного присутствия в объектах окружающей среды патогенных микроорганизмов. Их наличие свидетельствует о загрязнении объекта выделениями человека и животных. СПМ должны отвечать следующим требованиям: должны обитать только в организме людей и животных и обнаруживаться в их выделениях; не длжны размножаться или обитать в почве и воде; сроки их выживания и устойчивость к различным факторам после выделения из организма в окружающую среду должны быть равными или превышать таковые у патогенных микроорганизмов; их свойства должны быть типичными и легко выявляемыми для их дифференциации; методы их обнаружения и идентификации должны быть простыми, экономически доступными; в окружающей среде не должно быть близко сходных обитателей – микроорганизмов.

Основными задачами санитарной микробиологии являются:

1. Разработка и совершенствование микробиологических методов исследования объектов окружающей среды (воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов, предметов обихода);

2. Изучение источников загрязнения окружающей среды разнообразной микрофлорой, представляющей опасность для человека;

3. Изучение жизнедеятельности микрофлоры в окружающей среде, особенно в условиях ее химического и биологического загрязнения;

4. Разработка нормативов для гигиенической оценки объектов окружающей среды, в т.ч. пищевых продуктов;

5. Разработка мероприятий по оздоровлению объектов окружающей среды и контроль за эффективностью этих мероприятий, включая контроль за качеством водоснабжения, работой предприятий пищевой промышленности и общественного питания, эффективностью обеззараживания сточных вод, отбросов и т.д.

Загрязненность почвы, воды, воздуха и других объектов определяется по общей микробной обсемененности и обнаружению СПМ – индикаторов наличия выделений человека или животных. В воде регистрируют кишечную палочку, БГКП (колиформные палочки), энтерококк, стафилококк; в почве – кишечную палочку, БГКП, клостридии перфрингенс, термофилы; на предметах обихода – БГКП, золотистый стафилококк, энтерококк.

Вода – естественная среда обитания для разнообразных микроорганизмов. В воде рек, открытых водоемов, морей, океанов обнаруживают представителей всех таксономических групп бактерий, а также грибы, водоросли и простейшие. Совокупность всех микроорганизмов, заселяющих водоемы, обозначают термином “микробиологический планктон”.

В соответствии с действующими нормативными документами санитарно-микробиологическому надзору подлежат:

• вода питьевая (централизованного и местного водоснабжения, т.е. из водопровода, колодцев, родников и скважин);

• вода плавательных бассейнов;

• вода открытых водоемов (рек, водохранилищ);

• сточные воды (хозяйственно-фекальные, промышленные, талые и ливневые;

• вода очищенная для приготовления лекарств;

• лед медицинский и хозяйственный;

Микрофлора водоема зависит от содержащихся в ней веществ и от биоценоза, т.е. от видового состава и численности других живых существ. Так, находящиеся в воде фаги, простейшие уничтожают бактерии. Микроорганизмы, способные образовывать антибиотики, вызывают гибель других бактерий, чувствительных к этим веществам.

Микроорганизмы воды играют значительную роль в круговороте веществ в природе. Они расщепляют органические вещества с образованием субстратов, которые используют в питании другие водные микроорганизмы. Биологическая активность в водоемах максимальна в летне-осенний период.

Воды поверхностных водоемов (реки, ручьи, озера, водохранилища) открыты для всех видов контаминации. Загрязнение их микроорганизмами, попадающими со сточными, ливневыми, талыми водами, резко изменяет микробный пейзаж и санитарный режим водоема. Основной путь микробного загрязнения водоемов – попадание неочищенных городских отходов и сточных вод. Количество микроорганизмов в воде поверхностных стоков в весенне-паводочный период увеличивается до 2,8-3 млн в 1 мл. В период паводка возможно вторичное загрязнение водопроводной сети. Микрофлора хозяйственно-фекальных сточных вод состоит из микроорганизмов, выделяемых из кишечника человека и животных, среди которых имеются представители нормальной и условно-патогенной флоры (эшерихии, энтерококки, клебсиеллы, клостридии, грибы рода Candida, простейшие и др.), но могут находиться и патогенные – возбудители кишечных инфекций (сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, иерсинии, лептоспиры, вирусы полиомиелита, гепатита А, Е и др.). Опасность заражения последними особенно велика, если в водоемы попадают недостаточно обеззараженные сточные воды инфекционных больниц.

При определении обсемененности воды рассчитывают коли-титр и коли-индекс. Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП, коли-индекс – количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Эти показатели определяют титрационным (бродильным) методом или методом мембранных фильтров. При титрационном методе проводят выделение и идентификацию бактерий на питательных средах. При методе мембранных фильтров воду сначала фильтруют, используя колбу Бунзена с вмонтированной в нее воронкой Зейтца с мембранным фильтром и с помощью вакуум-насоса прогоняют воду через фильтры, которые затем помещают на поверхность питательной среды в чашки Петри и после инкубации в термостате подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП, а затем с помощью биохимических тестов проводит их идентификацию.

Санитарно-микробиологический контроль качества питьевой воды. Санитарно-микробиологическое исследование питьевой воды включает определение ОМЧ, количества энтеробактерий, спор сульфитредуцирующих клостридий и колифагов.

Определение ОМЧ при оценке качества питьевой воды. Общее микробное число – количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в 1 см³ (1 мл) воды – определяют у всех видов воды. Исследуемую воду вносят по 1 мл в две стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным питательным агаром (метод глубинного посева). Инкубируют при 37⁰ С 24 ч, после чего при комнатной температуре еще 24 ч. Подсчитывают на 2-х чашках число выросших колоний (на поверхности и в глубине питательного агара) и рассчитывают среднее арифметическое значение. Для выявления плесневых и дрожжевых грибов исследуемую воду засевают по 0,5 мл на среду Сабуро и инкубируют при комнатной температуре в течение 3-4 сут. Подсчитывают число выросших колоний и также рассчитывают среднее арифметическое. Результат (ОМЧ) вычисляют путем суммирования среднего арифметического числа бактерий, дрожжевых и плесневых грибов и выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ/мл).

ОМЧ позволяет оценить уровень микробного загрязнения воды, дополняя показатели фекального загрязнения, и одновременно позволяет выявить загрязнение из других источников (например, промышленные сбросы). Неожиданное увеличение ОМЧ (даже в пределах норматива), выявленное повторно, служит сигналом для поиска причины загрязнения. Также этот показатель незаменим для срочного обнаружения в питьевой воде массивного микробного загрязнения неизвестной природы.

Определение количества энтеробактерий. Присутствие энтеробактерий (колиформных бактерий) также определяют во всех видах воды. Понятие колиформные бактерии включает бактерии семейства Enterobacteriaceae итермотолерантные колиформные бактерии.

Бактерии семейства Enterobacteriaceae включают грамотрицательные аспорогенные палочки, не обладающие оксидазной активностью и сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при 37⁰ С в течение 24-48 ч (или сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа при температуре 37⁰ С в течение 24 ч). Обнаружение в питьевой воде бактерий семейства Enterobacteriaceae указывает на потенциальную эпидемическую опасность водопользования. Показатель «бактерии семейства Enterobacteriaceae» - основной нормируемый показатель, обеспечивающий наиболее надежный контроль присутствия в воде практически всех представителей кишечных бактерий.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают теми же характеристиками, но дополнительно сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа при 44,5⁰ С через 24 ч. Термотолерантные колиформные бактерии быстро отмирают во внешней среде, поэтому их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.

Для определение энтеробактерий в питьевой воде используют метод мембранных фильтров. Исследуемую воду (3 пробы по 100 мл) пропускают через 3 бактериальных фильтра из нитроцеллюлозы, которые затем помещают на среду Эндо и инкубируют при 37⁰ С 24 ч. Подсчитывают количество выросших на фильтрах лактозоположительных колоний, идентифицированных как колиформные бактерии. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и определяют оксидазную активность. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилдиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5 % раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37 ⁰С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Выявление спор сульфитредуцирующих клостридий. Споры сульфитредуцирующих клостридий более устойчивы к обеззараживанию и действию неблагоприятных факторов окружающей среды, чем другие индикаторные бактерии. На основании этого свойства показатель рекомендован для оценки эффективности технологических процессов очистки воды. Особое значение этот показатель имеет при оценке первичного хлорирования, так как оно инактивирует практически все индикаторные бактерии. Обнаружение клостридий в воде перед поступлением в распределительную сеть указывает на недостаточную очистку и на то, что устойчивые к обеззараживанию патогенные микроорганизмы, вероятно, не погибли при очистке.

Для определения клостридий испытуемую воду вносят в расплавленную и остуженную среду Вильсона-Блера. Среда содержит тиосульфат (гипосульфит) и бесцветную соль железа. В результате прорастания спор, размножения клостридий и восстановления ими сульфита образуется сульфид железа, придающий среде черный цвет.

Определение количества колифагов. Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на E.coli) определяют в воде поверхностных источников и питьевой воде, подготовленной из нее, а также в сточных водах. Они являются индикаторами эффективности охраны грунтовых вод и очистки питьевой воды. Исследование проводят методом агаровых слоев Грациа. Для титрования колифагов исследуемую воду смешивают с расплавленным и остуженным питательным агаром, куда вносят также индикаторный штамм E.coli. Полученную смесь выливают вторым слоем на питательный агар в чашке Петри и после застывания среды чашку инкубируют при 37⁰С 24 ч. В результате индикаторная культура образует равномерный сплошной рост, а при наличии колифагов в этом «газоне» образуются прозрачные бляшки («негативные колонии» бактериофагов). Результат исследования выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ/мл).

К бактериям группы кишечной палочки (БГКП) относятся грамотрицательные палочки, не образующие спор, ферментирующие лактозу с образованием кислоты и газа при 370,5 ⁰С в течение 24 – 48 часов или ферментирующие глюкозу с образованием кислоты и газа при 370,5 ⁰С в течение 24 часов, и не обладающие оксидазной активностью.

Обнаружение в воде БГКП следует рассматривать как показатель фекального загрязнения воды, а их количество позволяет судить о степени этого загрязнения.

Количество БГКП определяют двумя методами:

1. Бродильний метод. Суть метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой воды и подращивании при 37⁰С в средах накопления (глюкозо – пептонная среда (ГПС) Эйкмана или среда Кесслера (лактозо – пептонная вода с желчью и генцианвиолетом для угнетения роста грамположительных бактерий)) с последующим высевом бактерий на среду Эндо, дифференцировании выросших бактерий и определении наиболее вероятного числа БГКП в 1 л воды (коли – индекс). При обнаружении бактериального загрязнения воды свыше допустимых норм должен проводиться повторный отбор проб с дополнительным исследованием на наличие бактерий – показателей свежего фекального загрязнения. Свежее фекальное загрязнение в воде устанавливают, определяя наличие грамотрицательных термотолерантных колиформных бактерий, фекальных кишечных палочек, ферментирующзих лактозу до кислоты и газа при температуре 43- 44 ⁰С в течение 24 часов в присутствии ингибиторов посторонней микрофлоры (0,32% борной кислоты) и не растущие на цитратной среде Симмонса или Козера. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На давнее фекальное загрязнение указывает отсутствие БГКП и наличие определенного количества клостридии перфрингенс, т.е. наиболее устойчивых спорообразующих бактерий.

В соответствии с нормативными документами (Государственными стандартами) регламентируются следующие показатели питьевой воды при централизованном водоснабжении:

• Общее микробное число воды (количество всех микроорганизмов, обнаруживаемых в 1 мл воды) – не должно превышать 100 микробов в 1 мл исследуемой воды;

• Коли – титр воды (наименьший объем воды, в котором обнаруживаются БГКП) – не менее 300 мл;

• Коли – индекс (количество БГКП в 1 л воды) – не более 3;

• Общие колиформные бактерии, термотолерантные колиформные бактерии, колифаги, кишечная палочка – должны отсутствовать в 100 мл исследуемой воды.

2. Метод мембранных фильтров. Для этого метода применяют мембранные ультрафильтры из нитроцеллюлозы, не пропускающие через свои поры кишечную палочку. Фильтры стерилизуют путем кипячения, затем закладывают в воронку фильтра Зейтца, вмонтированного в колбу, соединенную с насосом Камовского. Через фильтр пропускают определенный объем воды (1л), затем вынимают фильтр и помещают его в чашку со средой Эндо так, чтобы он прилегал к среде нижней стороной. Чашку помещают в термостат при t=37⁰C на сутки. Так, например, если на фильтре наблюдается рост двух колоний E. coli, то коли-титр будет равен 500, а коли-индекс – 2.

Конкретные цели:

• Ознакомиться с методами и объектами изучения санитарной микробиологии воды.

• Научиться трактовать методы и способы забора проб воды для определения СПМ.

• Изучить основные СПМ воды.

• Научиться анализировать и оценивать коли-титр и коли-индекс исследуемой воды.

Уметь: