Алгоритм лабораторной работы:

1. Приготовление мазков из культуры холерного вибриона.

2. Фиксация мазка пламенем.

3. Окраска микропрепаратов по Граму.

4. Микроскопия мазков при помощи иммерсионного микроскопа.

5. Демонстрация приготовления висячей и раздавленной капель.

6. Изучение подвижности в демонстрационных препаратах при помощи фазово-контрастного микроскопа.

7. Микроскопия и анализ демонстрационных препаратов.

8. Зарисовка препаратов в протокол.

9. Оформление протокола.

Методическое указание для студентов к практическому занятию № 4

Тема: Споры. Спорообразование. Методы окраски спор.

Цель: Изучение морфологии спорообразующих микроорганизмов.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов.

Цель: Освоение практических навыков приготовления препаратов для окраски спор.

Содержательный модуль. Морфология и структура бактерий.

Тема занятия: Споры. Спорообразование. Методы окраски спор.

Актуальность темы. Знание морфологии имеет большое значение для микроскопического метода лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. Изучение морфологии бактерий осуществляется при микроскопии окрашенных микропрератов. Важно при этом выявить такие компоненты микробной клетки, как споры. Только незначительное количество бактерий образуют споры: клостридии столбняка, ботулизма, газовой раневой инфекции, возбудитель сибирской язвы, чумы. Дифференциальным признаком спор есть их расположение относительно клетки. Споры выявляют окрашиванием по методу Ганзена, Грама.

Споры - своеобразная форма покоящихся фирмикутных бактерий, т. е. бактерий с грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий, сопровождающихся высушиванием, дефицитом питательных веществ и т. д. При этом внутри одной бактерии образуется одна спора. Поэтому образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Спорообразующие аэробные бактерии, у которых размер споры не превышает диаметра клетки, называются бациллами, а спорообразующие анаэробные бактерии, у которых размер споры превышает диаметр клетки и они поэтому принимают форму веретена, называются клостридиями (от лат. clostridium - веретено).

Процесс спорообразования проходит ряд стадий, в течение которых часть цитоплазмы и хромосома отделяются, окружаясь цитоплазматической мембраной; образуется проспора, затем формируется многослойная плохо проницаемая оболочка. Спорообразование сопровождается интенсивным потреблением проспорой, а затем формирующейся оболочкой споры дипиколиновой кислоты и ионов кальция. После формирования всех структур спора приобретает термоустойчивость, которую связывают с наличием дипиколината кальция. Спорообразование, форма и расположение спор в клетке (вегетативной) являются видовым свойством бактерий, что позволяет отличать их друг от друга. Форма спор может быть овальной, шаровидной; расположение в клетке терминальное - на конце палочки (возбудитель столбняка), субтерминальное - ближе к концу палочки (возбудители ботулизма, газовой гангрены) и центральное (сибиреязвенная бацилла).

Специфические элементы споры, включая многослойную оболочку и дипиколинат кальция, обусловливают ее свойства: она долго может сохраняться в почве, например возбудители сибирской язвы и столбняка - десятки лет. В благоприятных условиях они прорастают, проходя три стадии: активацию, инициацию, вырастания. При этом из одной споры образуется одна бактерия. Активация - готовность к прорастанию. Она ускоряется при прогревании при температуре 60-80⁰С. Инициация прорастания длится несколько минут. Вырастание характеризуется быстрым ростом, сопровождающимся разрушением оболочки споры и выходом проростка.

Конкретные цели:

• Обучить методике приготовления бактериологического препарата для выявления спор.

• Практиковать методики окрашивания спор.

• Делать выводы о микроскопии бактериологических препаратов при использовании иммерсионного микроскопа.

• Описывать дифференциальные признаки расположения спор относительно микробной клетки.

• Практиковать результаты микроскопического исследования микро-препаратов.

• Проанализировать морфологию спорообразующих бактерий в целом.

Уметь:

• Готовить микропрепараты из спорообразующих бактерий;

• Окрашевать микропрепараты по Ганзену;

• Проводить микроскопию микропрепаратов при помощи иммерсионного микроскопа;

• Анализировать морфологию бактерий, образующих споры.

Теоретические вопросы:

1. В каких условиях и как происходит процесс спорообразования (стадии)?

2. Сравнительная устойчивость спор и вегетативной формы бактерий.

3. Использовать признаки спорообразования для идентификации бактерий.

4. Форма, расположение спор и их величина относительно диаметра вегета-тивной клетки, характерные для отдельных видов.

5. Назвать бактерии, образующие спору, и заболевания, вызванные ними. Объяснить, почему одни из них называются клостридиями, а другие – бациллами.

6. Основной метод окраски спор (по Ганзену).

Практические задачи, которые выполняются на занятии:

1. Приготовление микропрепаратов из спорообразующих бактерий.

2. Окраска микропрепаратов по Ганзену.

3. Микроскопия собственных микропрепаратов, их анализ и зарисовка в протокол.

4. Микроскопия демонстрационных препаратов: клостридии (терминальная, субтерминальная спора), бацилла (центральная спора), окраска по Ганзену и по Граму.

5. Зарисовка демонстрационных препаратов в протокол.

6. Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунолог-гією.– Київ: Вища школа, 1992.– 431с.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкола Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.– М.: Медицина, 1998.– 336с.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.– М.: ГЄОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редак-цией академика А.А. Воробьева,- М.: Медицинское информационное аген-тство, 2004.– 691с.

5. Конспект лекций.

Дополнительная литература:

4. Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка.– Київ.: Медицина, 2004.- С. 300-333.

5. Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии.– Харь-ков, 1986.– 125с.

6. Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской мик-робиологии и вирусологии.– Харьков, 2005.– 28 с.

Краткие методические указания к работе на практическом занятии.

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию.

Самостоятельная работа состоит из приготовления мазков из спорообразующих культур, окраски их по методу Ганзена, проведения микроскопии. Потом студенты зарисовывают микропрепараты и дают необходимые объяснения.

В состав самостоятельной работы входит также микроскопия демонстрационных препаратов и их зарисовка.

В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итогов результатов самостоятельной работы каждого студента.