Методические указания для студентов к практическому занятию № 32.

Тема занятия: Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции.

Цель: Изучение методов микробиологической диагностики, терапии и профилактики столбняка, ботулизма и газовой гангрены.

Модуль 2. Специальная, клиническая и экологическая микробиология.

Содержательный модуль 10. Патогенные прокариоты и эукариоты.

Тема 5: Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции.

Актуальность темы:

Возбудитель ботулизма

Ботулизм – инфекционная болезнь, характеризующаяся интоксикацией организма с преимущественным поражением ЦНС, возникающее в результате употребления пищевых продуктов, содержащих токсины Clostridium botulinum. Clostridium botulinum был выделен в 1896 г. Э. Ван-Эрменгемом из организма погибшего и остатков колбасы (лат. botulus — колбаса), употребление которой привело к смерти.

Таксономия. Возбудитель ботулизма относится к отделу Firmicutes, роду Clostridium.

Морфология и тинкториальные свойства. Возбудители ботулизма имеют форму палочек длиной 3—9 мкм, шириной 0,6—1 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминально расположенные споры и имеют вид теннисной ракетки. Капсулы не образуют, перитрихи. Грамположительны.

Культивирование. С. botulinum — строгий анаэроб. Оптимальная температура для роста 25—35 °С, рН среды 1,2—1,А. На кровяном агаре образует небольшие прозрачные колонии, окруженные зоной гемолиза. В высоком столбике сахарного агара колонии имеют вид пушинок или зерен чечевицы.

Ферментативная активность. С. botulinum обладает большим набором сахаролитических и протеолитических ферментов.

Антигенными свойствами, наиболее важными для идентификации возбудителя, обладает экзотоксин С. botulinum. Различают 7 сероваров возбудителя ботулизма — А, В, С, D, E, F, G, из которых наиболее распространены А, В, Е.

Факторы патогенности. С. botulinum выделяет экзотоксин, самый сильный из всех биологических ядов. Смертельная доза для человека равняется 0,3 мкг. Ботулинический экзотоксин оказывает нейротоксическое, гемагглютинирующее действие. Его осо­бенностью является высокая устойчивость к нагреванию (сохраняется в течение 10—15 мин при 100°С), кислой реакции, высоким концентрациям поваренной соли, замораживанию, пищеварительным ферментам.

Резистентность. Споры С. botulinum обладают очень высокой резистентностью к высоким температурам (выдерживают кипя­чение в течение 3—5 ч).

Восприимчивость животных. К экзотоксину возбудителя ботулизма наиболее чувствительны лошади, морские свинки, белые мыши и другие животные.

Эпидемиология. Возбудитель ботулизма широко распространен в природе. Его обнаруживают в организме животных, рыб, ракообразных, откуда он попадает в почву и воду. В почве С. botulinum долгое время сохраняется в виде спор и даже может размножаться, что позволяет отнести ботулизм к сапронозным инфекциям. Из почвы ботулиническая палочка попадает в пищевые продукты, где размножается и выделяет экзотоксин. Путь передачи инфекции — пищевой. Чаще всего фактором пе­редачи инфекции являются консервы (грибные, овощные, мясные, рыбные). От человека человеку заболевание не передается.

Патогенез. Ботулинический токсин попадает с пищей в пищеварительный тракт. Устойчивый к действию пищеварительных ферментов, токсин всасывается через стенку кишечника в кровь и обусловливает длительную токсинемию. Токсин связывается нервными клетками и блокирует передачу импульсов через нервно-мышечные синапсы. В результате развивается паралич мышц гортани, глотки, дыхательных мышц, что приводит к нарушению глотания и дыхания, наблюдаются изменения со стороны органов зрения.

Клиническая картина. Инкубационный период продолжается от 6—24 ч до 2—6 дней. Чем короче инкубационный период, тем тяжелее протекает болезнь. Обычно заболевание начинается остро, но температура тела при этом остается нормальной. Возможны различные варианты ботулизма — с преобладанием симптомов поражения пищеварительного тракта, расстройство зрения или дыхательной функции. В первом случае заболевание начинается с появления сухости во рту, тошноты, рвоты, поноса. Во втором — первые проявления болезни связаны с нарушениями зрения (больной жалуется на «туман» перед глазами и двоение). В результате паралича мышц гортани появляется осиплость, а затем голос пропадает. Больные могут погибнуть от паралича дыхания. Заболевание может осложниться острой пнев­монией, токсическим миокардитом, сепсисом. Летальность при ботулизме составляет 15—30 %.

Иммунитет. Постинфекционный иммунитет не формируется. Антитела, которые вырабатываются в течение заболевания, направлены против определенного серовара.

Микробиологическая диагностика. Материалом для выявления ботулотоксина служат сыворотка крови, моча, испражнения, промывные воды желудка больного, остатки пищи или подозреваемые продукты (колбасы, мясные, рыбные, фруктовые, овощные консервы и др.). Для обнаружения ботулотоксина в сыворотке крови больного ставят РПГА с эритроцитами, нагруженными моновалентными антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, Е. В качестве контроля берут нормальную сыворотку крови. Обнаружение ботулотоксина в пищевых продуктах и определение токсигенности С. botulinum проводят в реакции нейтрализации токсина на белых мышах. Для определения серотипа токсина реакцию ставят с моновалентными сыворотками типов А, В, Е. При нейтрализации токсина гомологичной антитоксической сывороткой мыши остаются живыми.

Лечение. Используют антитоксические противоботулинические гетерологичные сыворотки и гомологичные иммуноглобулины.

Профилактика. Основную роль в предупреждении ботулизма играет соблюдение определенных правил приготовления продуктов, прежде всего домашних консервов. Для специфической профилактики ботулизма ограничено применяют тетра- и триана-токсин, в состав которых входят ботулинические анатоксины типов А, В, Е. Экстренная профилактика осуществляется с помощью противоботулинических сывороток.

Возбудитель столбняка

Столбняк (tetanus) — тяжелая раневая инфекция, вызываемая Clostridium tetani, характеризующаяся поражением нервной системы, приступами тонических и клонических судорог. Возбудитель столбняка открыт в 1884 г. Э. Николайером и С. Китазато.

Морфология и культивирование. Столбнячная палочка — строгий анаэроб, грамположительна, ее размеры 0,5—1,7x2—18 мкм; перитрих, образует терминально расположенную круглую спору, продуцирует сильный экзотоксин при выращивании на жидких питательных средах. На плотных питательных средах формирует прозрачные или слегка сероватые колонии с шероховатой поверхностью; не расщепляет углеводов, обладает слабыми протеолитическими свойствами.

Антигенная структура. По Н-антигену С. tetani делят на 10 сероваров. О-Антиген является общим для всех представителей вида. Все серовары продуцируют однородный токсин, нейтрализующийся иммунной сывороткой против токсина любого серовара.

Факторы патогенности. Основным фактором патогенности является экзотоксин. Столбнячный токсин представляет собой белок с молекулярной массой около 150 кД. Состоит из тетанолизина и тетаноспазмина, оказывающих гемолитическое и спастическое действие. К столбнячному токсину чувствительны человек, мыши, морские свинки, кролики и другие животные.

Резистентность и экология. С. tetani распространен повсеместно. Являясь нормальным обитателем кишечника человека и животных, он попадает в почву, где в виде спор может сохраняться годами, десятилетиями. Столбнячная палочка весьма устойчива к дезинфектантам. При кипячении споры погибают через 50—60 мин.

Эпидемиология. Столбняк распространен повсеместно, вызывая спорадическую заболеваемость с высокой летальностью. Заражение происходит при проникновении возбудителя в организм через дефекты кожи и слизистых оболочек при ранениях (боевых, производственных, бытовых), ожогах, отморожениях, через операционные раны. При инфицировании пуповины возможно развитие столбняка у новорожденных. Больной столбняком не заразен для окружающих.

Патогенез. Главным патогенетическим фактором является столбнячный токсин, который распространяется с места размножения возбудителя (в ране) по кровеносным и лимфатическим сосудам, нервным стволам, вызывая поражение нервной системы. Поражаются нервные окончания синапсов, секретирующие медиаторы (ацетилхолин и другие вещества), нарушается проведение импульсов по нервным волокнам. При столбняке поражается не только нервная система: в патологический процесс вовлекаются практически все системы организма.

Клиническая картина. Инкубационный период составляет 6— 14 дней. У больных наблюдаются спазм жевательных мышц, затрудненное глотание, напряжение мышц затылка, спины (туловище принимает дугообразное положение — опистотонус), судороги мышц всего тела, повышенная чувствительность к различным раздражителям. Заболевание протекает при повышенной температуре тела и ясном сознании.

Иммунитет. После перенесенной болезни иммунитет не вырабатывается. От матери, вакцинированной против столбняка, новорожденным передается непродолжительный пассивный антитоксический иммунитет.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследования: кусочки ткани вокруг предполагаемых входных ворот инфекции, гной, перевязочный материал, кетгут. При подозрении на столбняк у женщин после родов или аборта — выделения из матки.

Бактериологическое исследование. Материал засевают в среду Китта—-Тароцци и инкубируют в анаэробных условиях при 37°С в течение 3—4 сут., наблюдая придонный рост бактерий. Затем делают посевы на сахарный агар в чашки Петри, в столбик сахарного питательного агара в пробирке. Посевы также инкубируют в анаэробных условиях.

На поверхности кровяного агара Cl. tetani образует нежные прозрачные колонии, окруженные малозаметной зоной гемолиза. Для получения чистой культуры подозрительные колонии пересевают в пробирки со средой Китта—Тароцци и сохраняют их под слоем вазелинового масла или в эксикаторе, заполненном смесью инертных газов.

Биопроба — основной метод лабораторной диагностики столбняка. Проводится для обнаружения столбнячного токсина в исследуемом материале. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают изотоническим раствором хлорида натрия для экстрагирования токсина и фильтруют через бумажный фильтр. Часть фильтрата смешивают с антитоксической сывороткой и внутримышечно вводят белым мышам (контрольная группа), подопытным животным вводят один фильтрат. Через 1—2 сут у мышей появляется ригидность мышц хвоста и задних конечностей. В результате резкого сокращения хвостовых мышц хвост поднимается в виде дуги. Затем подопытные животные погибают. Для определения токсигенности выделенной культуры белым мышам вводят надосадочную жидкость, полученную при центрифугировании этой культуры, выращенной на жидкой питательной среде.

Лечение. Применяют противостолбнячную антитоксическую сыворотку или противостолбнячный иммуноглобулин человека.

Профилактика. При обширных травмах необходимо обратиться к врачу. Проводят хирургическую обработку раны. Надежным способом защиты от столбняка является специфическая профилактика, которая состоит в проведении плановой профилакти­ческой и экстренной иммунизации. Экстренная активная иммунизация осуществляется у привитых детей и взрослых при травмах, ожогах и отморожениях, укусах животных, внебольничных абортах введением 0,5 мл столбнячного анатоксина; непривитым вводят 1 мл столбнячного анатоксина и 250 ME человеческого иммуноглобулина. При отсутствии последнего вводят после предварительной внутрикожной пробы противостолбнячную гетерологичную сыворотку в дозе 3000 ME.

Для создания искусственного активного иммунитета в плановом порядке применяют адсорбированный столбнячный анатоксин в составе вакцин АКДС и АДС или секстанатоксина

Возбудители анаэробной инфекции

Анаэробная инфекция — инфекционное заболевание, вызываемое анаэробами, характеризующееся общей интоксикацией, некрозом тканей, их распадом. Обычно под анаэробной инфекцией понимают раневую инфекцию, однако анаэробы могут поражать любые органы и ткани.

Анаэробная инфекция вызывается облигатными анаэробами, разделяющимися на 2 группы: бактерии, образующие споры (клостридии), и бактерии, не образующие спор, или так называемые неклостридиальные анаэробы. Раневая инфекция, вызванная бактериями рода Clostridium (С. perfringens, С. novyi, С. ramosum и др.), называется газовой гангреной.

Морфология и культивирование. Возбудители газовой гангрены — палочковидные грамположительные бактерии (отдел Firmicutes), образующие овальные споры, в диаметре превышающие поперечник вегетативной части. В пораженных тканях клостридии газовой гангрены формируют капсулу. Культивируются на жидких и плотных питательных средах в анаэробных условиях.

Факторы патогенности. Продуцируют экзотоксины, специфические для каждого вида, воздействующие на ЦНС; выделяют ферменты (коллагеназу, гиалуронидазу, дезоксирибонуклеазу), разрушающие соединительную ткань, а также гемолизин, разрушающий эритроциты.

Резистентность и экология. Вегетативные формы клостридии чувствительны к кислороду, солнечному свету, высокой температуре, кислотам, дезинфицирующим средствам. Споры в противоположность вегетативным формам устойчивы к высоким температурам, кислотам и другим физическим и химическим факторам.

Возбудители газовой гангрены, являясь нормальными обитателями кишечника животных и человека, с фекалиями попадают в почву, где споры длительное время сохраняются. В некоторых почвах клостридии могут размножаться.

Восприимчивость животных. К заражению возбудителями газовой гангрены чувствительны кролики, морские свинки, мыши.

Эпидемиология. Газовая гангрена в связи с широкой распространенностью возбудителя встречается довольно часто, особенно при массовых ранениях и травмах (войны, катастрофы) и несвоевременной хирургической обработке ран.

Патогенез и клиническая картина. Газовая гангрена развивается в результате попадания возбудителей в рану, особенно при наличии в ране некротизированных тканей, снижении резистентности организма. Образуемые вегетативными формами клостридий токсины и ферменты приводят к повреждению здоровых тканей и тяжелой общей интоксикации организма. Инкубационный период короткий — 1—3 дня, клиническая картина разнообразна и сводится к отеку, газообразованию в ране, нагноению с интоксикацией. Течение болезни усугубляют сопутствующие микроорганизмы (стафилококки, протеи, кишечная палочка, бактероиды и др.).

Иммунитет. Перенесенная инфекция не создает иммунитета. Ведущая роль в защите от Токсина принадлежит антитоксическому иммунитету.

Микробиологическая диагностика.

Бактериоскопическое исследование. Проводится путем микроскопии мазков, приготовленных из отечной жидкости или некротизированной ткани. Наличие в препаратах крупных грамположительных палочек, часть из которых образует капсулу, позволяет поставить предварительный диагноз.

Бактериологическое исследование.

Материал вносят в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци, со средой Вильсона-Блера и молоком. Часть пробирок прогревают при 80⁰С в течение 30 мин для уничтожения неспорообразующих бактерий. Посевы инкубируют в обычном термостате при 37°С. C. perfringens растет в глубине среды. В молоке уже через 3—4 часа после посева образуется губкообразный сгусток, содержащий пузырьки газа и отделившуюся прозрачную жидкость. На следующие сутки на среде Китта-Тароцци отмечается помутнение и газообразование, а на среде Вильсона-Блера несколько позднее появляются черные колонии в глубине агарового столбика. Из всех посевов делают мазки, окрашивают их по Грамму и микроскопируют.

При положительном результате обнаруживают крупные грамположительные палочки C. perfringens. Для получения чистой культуры делают пересевы на сахарно-кровной агар в чашки Петри, которые инкубируют в строго анаэробных условиях при 37⁰С в течение 3-4 дней. Выросшие колонии пересевают в пробирки со средой Китта-Тароцци, затем производят идентификацию на основании дифференциальных признаков.

Для определении токсигености исследуемую культуру, выращенную на среде Кита-Тароцци, центрифугируют и надосадочную жидкость вводят морской свинке, которая при положительном результате погибает.

Для быстрого обнаружения токсина C. perfringens в раневом отделяемом определяют его лецитиназную активность. Положительная реакция на лецитиназу выявляется помутнением жидкости в пробирке. При отрицательной реакции, характеризующейся нейтрализацией фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной.

Вследствие того, что токсины разных видов клостридий различаются по своим антигенным свойствам, их серологическую идентификацию проводят в реакции нейтрализации на лабораторных животных. С этой целью смесь исследуемого токсина с антитоксической сывороткой (C. perfringens или С. novyi) вводят подкожно морской свинке. В случае нейтрализации токсина животное остается живым; при отрицательной реакции морская свинка погибает через 30 мин—4ч после инъекции.

Лечение хирургическое: иссечение всех омертвевших тканей. После операции назначают антибиотики широкого спектра действия, противогангренозную антитоксическую сыворотку.

Профилактика. Правильная хирургическая обработка ран, соблюдение асептики и антисептики при операциях.

Для активной иммунизации применяют анатоксины против газовой гангрены в составе секстанатоксина; прививки проводят по специальным показаниям (военнослужащие, землекопы и др.).

Неспорообразующие анаэробы

Неспорообразующие анаэробы (неклостридиальные) — это грамотрицательные (бактероиды, фузобактерии, вейллонеллы) и грамположительные (актиномицеты, пептококки, пептострептококки), палочковидные и кокковидные бактерии с разнообразными биологическими свойствами. Составляют обширную группу облигатных анаэробов, состоящую из различных таксономических категорий.

Культивируются в строгих анаэробных условиях (обычно в атмосфере из смеси N₂, CO₂ и Н₂). Неспорообразующие анаэробы отличаются полиморфизмом, обладают различной степенью ферментативной активности. Антигенные свойства у отдельных видов изучены недостаточно. Факторами патогенности являются капсулы, ферменты, липополисахарид у грамотрицательных бактерий.

Возбудители быстро погибают в аэробных условиях. На воздействие физических и химических факторов реагируют так же, как и не образующие спор бактерии. Чувствительность к антибиотикам индивидуальная. Грамотрицательные анаэробы (например, наиболее типичный представитель Bacteroides fragilis) нечувствительны к аминогликозидам (гентамицину, канамицину), чувствительны к метронидазолу (трихополу), клиндамицину и некоторым другим антибиотикам широкого спектра действия.

Неспорообразующие анаэробы (бактероиды, фузобактерии, порфиромонады, превотеллы и др.) являются составной частью нормальной микрофлоры человека. Особенно обильно населены ими слизистые оболочки ротовой полости, толстой кишки и половых органов у женщин.

Эпидемиология инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробами, не изучена. Заболевания чаще вызываются собственными, эндогенными бактериями, главным образом при снижении резистентности организма хозяина.

Неспорообразующие анаэробы вызывают самые разнообразные гнойно-воспалительные процессы: в челюстно-лицевой области, легких, печени, поражают мочеполовую систему, опорно-двигательный аппарат, вызывают аппендицит, перитонит, сепсис. Обычно это смешанные инфекции, вызываемые ассоциациями анаэробов с аэробами.

Иммунитет не изучен.

Для микробиологической диагностики используют гной или пораженную ткань, кровь; проводят бактериоскопию и бактериологическое исследование; для обнаружения анаэробов применяют газожидкостную хроматографию, ИФА и др. Обязательна антибиотикограмма.

Лечение часто хирургическое в сочетании с антибактериальными препаратами: метронидазолом, клиндамицином, цефалоспориновыми антибиотиками. Могут применяться левомицетин, эритромицин.

Специфическая профилактика отсутствует.

Конкретные цели:

• Ознакомиться с эволюцией клостридий, классификацией.

• Объяснять токсигенность клостридий.

• Научиться трактовать свойства клостридий анаэробной инфекции ран, столбняка, ботулизма.

• Ознакомиться с особенностями патогенеза.

• Определить методы микробиологической диагностики газовой раневой инфекции, столбняка, ботулизма.

• Ознакомиться со специфической терапией и профилактикой анаэробных инфекций.

Уметь:

• Осуществить посев на питательные среды исследуемого материала.

• Приготовить мазки и окрасить по Граму.

• Провести микроскопию препаратов с помощью иммерсионного микроскопа.

• Анализировать морфологические, культуральные, ферментативные признаки анаэробных бактерий.

Теоретические вопросы:

1. Характеристика возбудителей анаэробной инфекции. Биологические свойства.

2. Классификация анаэробов.

3. Свойства клостридий.

4. Резистентность к факторам окружающей среды.

5. Генетический контроль токсинообразования.

6. Эпидемиология, патогенез и клинические особенности анаэробной инфекции.

7. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций, столбняка, ботулизма.

8. Специфическая терапия, профилактика анаэробных инфекций.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Микроскопия демонстрационных препаратов из чистых культур анаэробных бактерий, зарисовка их в альбом.

2. Изучение собственных высевов грунта на среду Китта-Тароцци и молоко под маслом (описание характера роста, приготовление мазков и зокраска их по Грамму).

3. Микроскопия собственных микропрепаратов, их анализ и зарисовывание в протокол.

4. Разбор схемы лабораторной диагностики столбняка, ботулизма и раневой инфекции.

5. Оформление протокола.

Литература:

1. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, иммунология и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, Санкт-Петербург «Специальная литература», 1998. - 592с.

2. Тимаков В.Д., ЛевашевВ.С., Борисов Л.Б. Микробиология / Учебник.-2-е изд., перераб. и доп.- М.:Медицина, 1983,-512с.

3. Пяткин К.Д. Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией. - Киев: Вища школа, 1992. - 431с.

4. Медицинская микробиология / Под редакцией В.И. Покровского. -М.:ГЕОТАР-МЕД, 2001.-768с.

5. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, иммунологии и вирусологии. Под ред. М.П. Зыкова. М. «Медицина». – 1977. – 288 с.

6. Черкес Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельскан Н.А. Микробиология. /Под ред. Ф.К. Черкес. – М.: Медицина, 1986. – 512 с.

7. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Макияров К.А. Микробиология, вирусология и иммунология. Алма-Ата, «Казахстан», 1974. – 372 с.

2. Тiтов М.В. Iнфекцiйнi хвороби. - К., 1995. – 321с.

3. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. - М.: Медицина, 1990. - 559 с.

4. БМЭ, Т. 1, 2, 7.

5. Павлович С.А. Медицинская микробиология в графах: Учеб. пособие для мед. ин-тов. – Мн.: Выш. шк., 1986. – 255 с.