Osnovy_vzaimodejstviya_ultrazvuka_s_biologicheskimi_obektami

1

Рис. 3.3. Яма с шариком - простейшая модель возможных состояний сложной биологической системы:

1 - основное состояние; 2 кпазистациопарные состояния

Биосистема в целом обычно находится в квазистационарном равновесии, как, например, шарик на дне ямы с пологими стенами и ямками различного размер а, расположенными в разных местах на стенках ямы (рис. 3.3). Небольшие воздействия могут вывести систему из стационарного состоян ия, но защитные механизмы вернут ее обратно, подобно тому, как воздействие на шарик в яме выведет его из самой низкой точки, но под действием сил тяжести шарик снова скатится на дно. Такая модель хорошо известна в физике как модель частицы в потенциальной яме.

Если биосистема долго остается в некотором новом состоянии (в углублении на стенке основной ямы), то в ней н ачинают происходить структурные изменения (шарик как бы продавливает дно новой ямки и увеличивает ее глубину), и вероятность того, что система и дальше будет находиться в этом состоянии, увеличивается. В этом случае систему можно рассматривать как новую, образованную из исходной в результате определенной перестройки. Процессы перестройки углубляются со временем, и чем дальше, тем сложнее повернуть их вс пять и тем более энергичные требуются воздействия, чтобы вернуть систему в исходн ое состояние.

Такое представление о би ологической системе не противоречит из вестному факту, что болезнь тем легче поддается лечению, чем раньше оно начинается.

Живой организм как система реагирует на возмущения - сигналы из окружающей среды, прогнозирует ее возможные изменения в будущем и с помощью своих регуляторных механизмов так изменяет свои параметры, чтобы подготовиться к о птимальному функционированию в нов ых условиях.

Рис. 3.4. Области состояний системы, характеризуемой двумя параметрами: 1 - область рабочих состояний; 2 ~ область допустимых состояний

Если систему характеризуют два параметра -АиВ, то в координатах А,В (на фазовой плоскости) каждому состоянию системы i будет соответствовать изображающая точка с координатами (Аi Bi) (рис, 3.4). Совокупность всех изображающих точек составит область допустимых состояний системы.

Характеристики любой системы могут меняться лишь в ограниченных пределах, в области допустимых состояний. Выход изображающей точки за границы области означает либо разрушение системы, либо ее превращение в новую систему с другим набором параметров. В реальных условиях параметры системы меняются в более узких пределах, образуя область рабочих состояний, причем эта область, очевидно, целиком лежит в пределах области допустимых состояний.

Сложные, в том числе и биологические, системы характеризуются не двумя, а значительно большим числом параметров. Поэтому состояние системы определяется точкой в фазовом пространстве, размерность которого n равна числу свойств, характеризующих систему.

Например, состояние человека характеризуется массой его тела, температурой, давлением крови, скоростью оседания эритроцитов и множеством других параметров.

Влияние ультразвука на биосистемы проявляется па всех уровнях организации, начиная с молекулярного и кончая организменным, и зависит как от параметров, характеризующих ультразвуковое поле, так и от свойств среды и состояния системы. Реакция биосистем на ультразвук тем более сложна и трудно предсказуема, чем сложнее механизм ее функционирования, чем выше ее структурная организация.

3.2.ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАЗВУКА НА БИОМАКРОМОЛЕКУЛЫ

ВРАСТВОРАХ

Впоисках первичных механизмов биологического действия ультразвука нередко исследуют влияние ультразвука на свойства простых веществ и биополимеров либо в растворах отдельных веществ или групп веществ, либо непосредственно в организме.

Два методических подхода - исследование действия ультразвука на систему в целом и на ее отдельные элементы - дополняя друг друга, позволяют оценить зависимость ультразвуковой резистентности макромолекул и макромолекулярных комплексов от их структуры и свойств, а также от свойств среды. Кроме того, такие исследования дают возможность определить, какими свойствами среды обусловлено превалирующее влияние одного или нескольких факторов из числа тех, из которых складывается физико- химическое и биологическое действие ультразвука.

Лучше всего изучено действие ультразвука на водные растворы аминокислот, оснований, белков и нуклеиновых кислот.

Аминокислоты в поле интенсивного ультразвука (10 Вт/см2, 0,6...0,8 МГц) в течение нескольких часов синтезируются из более простых веществ и сами испытывают существенные химические превращения. Однако и низкие интенсивности ультразвука способны заметно изменить их свойства.

Так, уже при 0,3 Вт/см2 (0,9 МГц) после 10…15-минутной ультразвуковой обработки наблюдаются изменения в оптических спектрах поглощения водных и водно-солевых

растворов фенилаланина, тирозина и триптофана. Причем, как облучение ультразвуком раствора аминокислоты, так и растворение аминокислоты в воде, предварительно подвергнутой действию ультразвука, приводит к качественно одинаковым результатам.

Очевидно, наблюдаемые изменения в основном обусловлены взаимодействием молекул аминокислот с И2О2, HNO2, НNО3, образующихся под влиянием ультразвука в водных, насыщенных воздухом растворах.

Относительно малые изменения, обнаруженные при растворении аминокислот в предварительно обработанной ультразвуком воде, объясняются более низкой химической активностью, в частности, H2O2, HNO2 и HNO3, по сравнению с активностью промежуточных продуктов их образования.

Длительное облучение ультразвуком (2,6 МГц; 3 Вт/см2; 3 ч) в присутствии воздуха приводит к разрыву ароматического кольца в молекуле триптофана. Получасовая обработка насыщенного воздухом водного раствора цистеина ультразвуком (0,8 МГц 5 Вт/см2) приводит к полному блокированию его SH-групп, чего не наблюдается в свобод- ной от азота среде.

Пуриновые и пиримидиновые основания в растворе также испытывают заметные изменения под действием ультразвука. По чувствительности к ультразвуку (5 Вт/см2,1 МГц) они образуют следующий ряд: тимидин —> уридин —> цитозин —> аденин. Пороговая интенсивность, при которой возникают изменения в тимидине и уридине, составляет около 0,5 Вт/см2. Насыщение раствора закисью азота N2O полностью подавля- ет эффект ультразвукового воздействия. Последнее свидетельствует о радикально-цепной природе ультразвукового воздействия, так как N2O является эффективным акцептором свободных радикалов.

Широкое использование ультразвука в медицинской диагностике, терапии и биотехнологии вызывает острую необходимость изучения его влияния на ферменты и другие биологически важные объекты па молекулярном уровне.

Ультразвук заметно влияет на структуру и функции белков и нуклеиновых кислот. Эти изменения зависят от размеров и формы молекул, от природы присутствующих в растворе посторонних веществ и параметров ультразвукового поля.

Белки, имеющие компактную, глобулярную форму, менее чувствительны к ультразвуку, чем фибриллярные белки.

Например, полная необратимая инактивация химотрипсина в разбавленных растворах (4 10-5 М) под действием ультразвука с интенсивностью 2 Вт/см2 (0,9 МГц) при комнатной температуре достигается лишь в результате 40-минутного воздействия.

Предполагается, что инактивация фермента в основном обусловлена влиянием свободных радикалов, образующихся в облучаемых ультразвуком растворах. Об этом свидетельствует характер зависимости скорости инактивации -химотрипсина от интенсивности ультразвука, а также от природы насыщающего облучаемый раствор газа (кислород, азот, аргон, углекислый газ) и присутствия в растворе акцепторов свободных радикалов или ингибиторов свободнорадикальных процессов.

Цистеин, аланин, лейцин, гистидин, метионин, валин, глутамин, а также аскорбиновая кислота, сыворочный альбумин и гликоген в различной степени защищают облучаемый ультразвуком фермент от разрушения.

Полагают, что эти вещества могут взаимодействовать с активным центром фермента, образуя подобие фермент-субстратного комплекса, более устойчивого, чем только фермент, к ультразвуковому воздействию. Однако, скорее всего, эффект обусловлен конкурентным взаимодействием этих веществ со свободными радикалами, образующи- мися в жидкости под действием ультразвука,

В настоящее время проведены систематические исследования ультразвуковой инактивации пероксидазы хрена, тиреоид-пероксидазы человека (ТПЧ), каталазы печени быка и уреазы соевых бобов в связи с большой практической важностью перечисленных объектов в медицине и иммунобиотехнологии.

Проведенные исследования показали важную роль молекулярной массы, структуры, концентрации фермента и свойств среды (рН, присутствие органических сорастворигелей) в кинетике ультразвуковой инактивации биокатализаторов. Особую роль в инактивации ферментов в ультразвуковом иоле играет их олигомерная структура.

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (Г6ФДГ по классификатору ферментов 1.1.1.49) содержится во всех клетках организма человека и животных, играет ключевую роль в пентозофосфатном цикле, так как поставляет восстановленный НАДФ Н для синтеза жирных кислот. Именно поэтому Г6ФДГ была выбрана в качестве объекта для изучения кинетики ее инактивации в водных растворах иод влиянием низкочастотного ультразвука (20,8 кГц) мощностью 53...65 Вт. Ультразвук низкой частоты применяется в биотехнологии для дезинтеграции клеточных структур, а также в хирургической медицинской практике (см. гл. А),

Ультразвуковая инактивация Г6ФДГ обнаруживает три четко выраженных стадии: лаг- период, продолжительность которого уменьшается с ростом плотности ультразвуковой энергии в среде; вторая, быстрая стадия, скорость которой зависит от плотности ультразвуковой энергии; третья, медленная стадия потери активности фермента.

Ясно, что при повышении температуры от 36 до 509С Г6ФДГ претерпевает термоинактивацию. По этой причине во всех случаях инактивацию Г6ФДГ под влиянием ультразвука сравнивают с термической инактивацией фермента в аналогичных условиях.

В течение двух часов Г6ФДГ в высоких концентрациях термостабильна, но с разбавлением фермента после лаг-периода его активность резко падает, а сама инактивация характеризуется двумя стадиями. Лаг-период сокращается с уменьшением концентрации фермента, а скорость инактивации во второй фазе процесса увеличивается с разбавлением Г6ФДГ, в результате чего его концентрация снижается с 20 до 3 нМ.

Термоинактивация Г6ФДГ при 39 оС не проявляется при концентрациях 20 и 10 нМ. Однако ультразвук инактивирует Г6ФДГ как при этой, так и при более высоких температурах (44 и 50 °С). Примечательно, что при воздействии на фермент ультразвуком лаг-период исчезает, а скорости его инактивации резко возрастают.

Повышение концентрации Г6ФДГ при всех температурах ведет к увеличению его устойчивости. Ультразвуковая составляющая инактивации фермента весьма значительна и возрастает с его разбавлением и повышением температуры.

Снижение скорости термо- и ультразвуковой инактивации ферментов с увеличением их концентрации известно для пероксидазы хрена, тиреоид-пероксидазы человека, тетрамерной каталазы печени быка, гомогексамерной уреазы соевых бобов и пр.

Скорее всего, снижение скорости термо- и ультразвуковой инактивации ферментов с увеличением их концентрации связано с ассоциацией молекул белков в агрегаты. Эти агрегаты более устойчивы к воздействию температуры и ультразвуковой кавитации, инициирующей в водной среде в присутствии кислорода появление активных свободных радикалов НО2 и НО. Характер зависимости скорости ультразвуковой инактивации от концентрации в случае олигомерных ферментов - димерных Г6ФДГ и тиреоид- пероксидазы человека, тетрамерной каталазы и гомогексамерной уреазы - может объясняться также влиянием ультразвука на степень диссоциации субъединичных белков на тримеры, димеры и отдельные субъединицы в отличие от термоинактивации олигомеров, когда действие ультразвука отсутствует вообще.

Несмотря на небольшой температурный интервал, в котором исследовалась термо- и ультразвуковая инактивация Г6ФДГ-азы, можно оценить эффективные энергии активации для суммарного процесса термоинактивации и ультразвуковой инактивации Г6ФДГ-азы.

Такое сравнение приведено в табл. 3.1, из которой следует, что во всех трех случаях Еакт до точки излома (36...44 °С) существенно ниже ее значений при более высоких температурах (44...50 °С). При термоинактивации наблюдается увеличение Еакт с ростом концентрации Г6ФДГ-азы от 3 до 20 нМ, в то время как в случае суммарной инактивации для ее ультразвуковой составляющей значения Еакт проходят через максимум при концентрации фермента 5 нМ.

Из табл. 3.1 следует также, что величины Еакт при концентрациях Г6ФДГ-азы 5...20 нМ минимальны для ультразвуковой составляющей процесса, выше - для суммарной инактивации и существенно возрастают при термоинактивации фермента, т. е. ультразвук снижает активационный барьер трансформации белка. Изломы на температурных зависимостях свидетельствуют о сходной природе инактивации при термической обработке белка и воздействии ультразвуком.

Таблица 3.1

Энергия активации (ккал/моль) суммарной термической и ультразвуковой (20,8 кГц; 62 Вт) инактивации Г6ФДГ в 0,1М.фосфатном буфере

Инактивация ферментов зависит также от кислотности среды. Так, Г6ФДГ-аза наиболее устойчива к ультразвуку и температуре в интервале рН = 6...8, в то время как ее суммарная, термо- и ультразвуковая инактивация заметно возрастают при рН == 8,6 и 9,1, т. е. в области, где фермент проявляет максимальную каталитическую активность и, следовательно, наибольшую конформационную лабильность.

Доля ультразвуковой составляющей в суммарной инактивации Г6Ф ДГ-азы меняется при разных рН среды и возрастает от 26...30 % при рН = 8,6..9,1 до 50...60 % при рН = 6,0,..7,4. Кинетические кривые, отражающие суммарную и ультразвуковую инактивации Г6ФДГ- азы, полностью согласуются с диссоциативной схемой потери активности этого субъединичного фермента.

При повышении концентрации Г6ФДГ в растворе существует в вид е тетрамера из четырех субъединиц (Е4), который представляет собой «димер обычного димера». В стабилизации связей между димерами главную роль играют ионные взаимодействия, а между субъединицами в димерах превалируют гидрофобные взаимодействия и водородные связи. Мономер Г6ФДГ-азы, как правило, каталитически не активен.

Схему инактивации Г6Ф ДГ-азы можно представить следующим образом:

где Е4, Е2, Е1 и EДен - тетрамер, димер, мономер фермента и его денатурированная форма, а константы скоростей прямых и обратных стадий.

Предполагается, что лаг- периоду па кинетических кривых инактивации соответствует диссоциация гетрамера на каталитически активные дим еры, Очевидно, что отношения активностей А/А0 при этом не уменьшаются. После окончания лаг-периода диссоциирует димер с лотерей каталитической активности.

Диссоциация димера Е2 с остоит из двух стадий - быстрой и медлен ной, что отражается в виде изломов на полулог арифмических анаморфозах кинетических кривых суммарной и чисто термической инактивации. В последней стадии каталитически неактивный мономер фермента необратимо ден атурирует.

При ультразвуковой кавитации с относительно высокими скоростями генерируются активные радикалы НО, O2,НO2 и атом Н превращающийся в радикал HO2 с частотой соударений:

Радикал HО играет превалирующую роль в ультразвуковой инактивации пероксидазы хрена, тиреоид-пероксид азы человека, каталазы, уреазы и многих других ферментов.

В случае Г6ФДГ-азы в течение лаг-периода продукты взаимодействия НО с аминокислотными остатками фермента ароматической природы накапливают, что приводит к диссоциации тетрамера в результате разрушения электр остатических связей.

Содержание ароматических аминокислотных остатков у глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназ довольно велико: 36-50 остатков тирозина (Тир), 40-64 остатка фенилаланина (Фен), 14-26

аминокислотных остатков гистидина (Тис) и 8-16 остатков триптофана (Три). Все пе- речисленные остатки с высокими скоростями реагируют с ПО: константы скорости равны для Гис 1,9 · 109, для Тир - 1,2 · 1010, для Три - 1,1 · 1010 и для Фен - 6,7 - 109 M-1c-1.

Реакции НО с ароматическими аминокислотными остатками способствуют разрушению водородных связей и нарушению гидрофобных взаимодействий, что приводит к диссоциации димeра Е2 до мономера Е1 с потерей каталитической активности Г6ФДГ - азы.

Поскольку строение активного центра Г6ФДГ-азы неизвестно, говорить о прямой атаке радикалов НО на аминокислотные остатки в этом центре не приходится.

Относительное влияние свободных радикалов на ультразвуковую инактивацию ферментов оценивается по воздействию на этот процесс скавенджеров (акцепторов) радикалов НО (маннитол, этанол) и ингибиторов свободнорадикальных процессов из ряда полифенолов и их полидисульфидов.

Следует отметить, что при отсутствии кавитации ультразвук низких (терапевтических) интенсивностей практически не меняет активности хороню очищенных ферментов в растворе, поэтому влияние ультразвука непосредственно на активность того или иного фермента не может служить первичным актом взаимодействия ультразвука с биологической системой.

Если белки иммобилизованы, т.е. связаны с поверхностью клеточных мембран или нерастворимых гранул-носителей, то ультразвук даже малых интенсивностей (0,2 Вт/см2, 0,88 МГц) заметно увеличивает скорость ферментативных реакций. Этот аффект скорее всею обусловлен ультразвуковыми микропотоками, перемешивающими гонкие слои жидкости у поверхности носителя к облегчающими диффузию субстрата к ферменту.

Молекулы фибриллярных белков, в отличие от глобулярных, довольно чувствительны к ультразвуку, В особенности те, структура которых не связана жесткими поперечными связями и может изменяться при относительно слабых воздействиях. К числу таких белкой относится мышечный белок - актомиозин.

Пятиминутное облучение растворов актомиозинов как скелетной, гак и гладкой мышц ультразвуком (1 Вт/см2; 0,88 МГц) не снижает их ферментативной активности, хотя характеристическая вязкость белка и число титруемых сулемой сульфгидрильных групп, оптические спектры поглощения растворов в области 210.,.350 им и степень спиральности белковых молекул существенно зависят от интенсивности ультразвука. Свойство молекул актомиозина образовывать в определенных условиях агрегаты также изменяется, что отражается не только на вязкости растворов белка, но и на сократительной способности актомиозиновых нитей, приготовленных прессованием поверхностных пленок из облученного ультразвуком (0,9..З Вт/см2; 2,6 МГц; 10 мин) актомиозина. Нити получаются рыхлыми, непрочными и в присутствии АТФ сокращаются в 1,2 1,5 раза меньше контрольных.

Вязкость и электропроводность растворов другого фибриллярного белка - фибриногена, а также электрофоретическая подвижность его молекул меняются уже в первые минуты воздействия ультразвуком с интенсивностью 0,2...1,5 Вт/см2.

Молекулы коллагена в водно-соленых растворах, облучаемых ультразвуком (0,2…2 Вт/см2; 0,88 МГц; 5...20 мин) при температуре 20...25°С, также испытывают существенные изменения, выражающиеся в изменении температуры и теплоты

денатурации коллагена. Энтальпия тепловой денатурации 0,3 %-ного раствора белка, изменяясь под действием ультразвука, достигает максимума при интенсивности 1 Вт/см2.

Аналогичная зависимость получена и при исследовании изменения коэффициента поляризации люминесценции раствора коллагена, облученного ультразвуком.

Можно предположить, что ультразвук низкой интенсивности вызывает частичную деполимеризацию молекул коллагена, а интенсивности, превышающие 1 Вт/см2, приводят к денатурации белка, причем скорость денатурации тем выше, чем выше интенсивность ультразвука.

В тканях ультразвук приводит к дестабилизации связей между молекулами коллагена и окружающим матриксом. Кратковременное облучение кожевой ткани ультразвуком (2 мин) па один-два порядка увеличивает количество экстрагируемого из нее коллагена.

Мощное низкочастотное ультразвуковое воздействие в 25 раз ускоряет разволокнение коллагеновых структур даже дубленой кожевой ткани, обрезки которой составляют отходы кожевенной промышленности.

Пользуясь различной чувствительностью белков к ультразвуку, можно избирательно, ингибируя тот или иной фермент в полиферментных системах, исследовать их роль в этих системах.

Молекулы ДНК и РНК в ультразвуковом поле (10 Вт/см2; 0,8 МГц) в первые же минуты облучения распадаются на фрагменты примерно равной молекулярной массы. Воздействие в течение нескольких часов приводит к появлению в растворе свободных нуклеотидов. По-видимому, это явление может наблюдаться и тогда, когда вероятность кавитации невелика или когда в каптирующем растворе присутствуют акцепторы свободных радикалов, т.е. деполимеризация макромолекул нуклеиновых кислот обусловлена в основном гидродинамическими силами, возникающими в ультразвуковом поле. Действительно, градиенты скоростей микропотоков вблизи пульсирующего газового пузырька по порядку величины 104…105 с-1 сравнимы со значениями градиентов в гидродинамических установках, при которых происходит деградация макромолекул.

При интенсивности ультразвука 0,2...1,5 Вт/см2 (0,9 МГц; 110... 120 мин) наряду с фрагментацией наблюдаются более тонкие изменения, выражающиеся в уменьшении прочности связей между нуклеиновыми кислотами и белками в нуклеопротеидных комплексах. Этот эффект наблюдается не только при облучении ультразвуком суспензии нуклеопротеидов в среде, но и при ультразвуковой обработке одной только водной среды с последующим субсидированием в ней нуклеопротеидных частиц. В основе этого эффекта, очевидно, лежит химическое взаимодействие между нуклеопротеидными комплексами и долгоживущими химически активными частицами, возникающими в водной среде под действием ультразвука.

Влияние образующихся в ультразвуковом поле химически активных веществ на ДНК и РНК не обязательно обусловливает денатурацию или деградацию макромолекул.

Например, взаимодействие нуклеиновой кислоты с NO2 может привести к замене одного основания (цитозина) другим (урацилом). Возможно, эта и аналогичные реакции являются одной из причин хромосомных нарушений, вызываемых ультразвуком (см. подразд. 3.2,4).

Как химическое, так и механическое действие ультразвука наблюдается во всех случаях, когда интенсивность ультразвука превышает порог кавитации. Однако, если воздействию

подвергаются низкомолекулярные частицы (мономеры, т-РНК), то превалирует химическое действие. Когда же молекулярный вес частиц велик (ДНК, м-РНК), то основную роль играют механические силы.

Под влиянием ультразвука изменяются и свойства нуклеопротеидных комплексов - эухроматина и гетерохроматина.

Среди множества способов дезинтеграции ультразвуковой метод, пожалуй, наиболее эффективен, технологичен и стабилен но воспроизводимости результатов, Однако не всегда можно отождествлять свойства исследуемых веществ в организме с их свойствами после выделения с помощью ультразвуковых методов. Здесь нужна разумная осторожность. Не следует забывать о возможных химических превращениях, обусловленных ультразвуком.

3.3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ Б КЛЕТКАХ

Реакции на ультразвук отдельных, не связанных друг с другом клеток и совокупности клеток различны, так как неодинаковы условия взаимодействия клеток и клеточных систем, например с микропотоками, а также потому, что па тканевом уровне функционирование отдельных клеток находится под контролем межклеточных регуляци- онных систем. Роль этих систем обнаруживается при сравнении действия ультразвука на клетки в суспензиях и тканях.

Так, в стоячей ультразвуковой волне (4...6 Вт/см2; 0,75...1 МГц) с клеток Не La в суспензии смываются поверхностные слои, отделяются нитевидные образования, в мембранах возникают дыры. Эти же клетки в монослое практически не испытывают изменений даже при впятеро большей интенсивности ультразвука.

Некоторые виды клеток в обычных условиях существуют в суспендированном состоянии. Это эритроциты, лейкоциты и другие клетки крови, сперматозоиды, бактерии, одноклеточные водоросли и пр. Другие клетки можно получить в виде суспензии, только применяя специальные методы. Чувствительность разных типов клеток к ультразвуковому воздействию весьма различна. Некоторые из них, например клетки амебы, выдерживают весьма интенсивное облучение. Так, после 10-минутной обработки ультразвуком интенсивностью 200 Вт/см2 (1 МГц) в суспензии остается 50% жизнеспособных особей, а клетки Не La в суспензии начинают разрушаться при 0,7 Вт/см2 (0,75 МГц,).

Одноклеточные, пожалуй, наиболее устойчивы к изменениям внешних условий, к действию различных физико-химических факторов, в том числе к действию ультразвука.

Механическая резистентность одноклеточных заметно меняется в зависимости от их величины, формы, особенностей строения, периода и жизненном цикле и т. д. Однако в среднем она достаточно высока, и многие одноклеточные остаются в суспензии целыми и жизнеспособными даже после облучения весьма интенсивным ультразвуком. Достаточно отметить, что еще никому не удавалось только с помощью ультразвука полностью избавиться от микроорганизмов в жидких средах, т.е. стерилизовать их.

Разрушению структуры клеток предшествуют заметные изменения их физиологического состояния, и если механическая резистентность клеток меняется и широких пределах (0,1.,.10 Вт/см2; 0,5...2 МГц; 1...104 с) в зависимости от типа клеток, то пороговые фи- зиологические изменения происходят в значительно более узкой области (0,1. ..0,5 В т/см

0,5.. .2 МГц; 10… 100 с).

Хорошей моделью для изучения изменений в клетках под влиянием ультразвука являются светящиеся бактерии. Их особая ферментативная система преобразует энергию окислительных реакций в электромагнитное излучение видимого диапазона (биолюминесценция), пропорциональное интенсивности метаболизма. Кинетику про- цессов, происходящих в клетке, можно оценивать на расстоянии по их свечению без вмешательства в жизнедеятельность объекта и с быстродействием регистрации, скорость которой заведомо превышает скорость любого биологического процесса. Для регистрации свечения существуют чувствительные, быстродействующие и сравнительно простые приборы и методы.

В интервале 0,05...0,4 Вт/см2 (0,88 МГц) биолюминесценция фотобактерий и стимулированная ультразвуком скорость их роста пропорциональны интенсивности ультразвука, но яркость свечения нарастает быстрее, чем количество клеток и единице объема. При интенсивности ультразвука, превышающей 0,6 В г/см2, наблюдается необратимое подавление люминесценции, сила которого увеличивается с повышением интенсивности ультразвука, хотя скорость роста бактерий при повышении интенсивности вплоть до 1,5 Вт/см2 меняется несущественно. В интервале 0,4...0,6 Вт/см2 видимых изменений в свечении бактерий не наблюдается. Очевидно, при этих интенсивностях эффекты подавления и стимуляции биолюминесценции оказываются равными.

Следует отметить, что реакция фотобактерий на ультразвук может заметно меняться в зависимости от их возраста, исходного состояния, наличия в среде тех или иных составляющих и т. д.

Отличия в чувствительности различных клеток к ультразвуковому воздействию связаны с их морфологическими особенностями и функциональным состоянием.

В первую очередь, резистентность клеток к ультразвуку определяется структурой их оболочки, в наибольшей степени подверженной влиянию факторов, действующих в ультразвуковом поле. В непосредственной близости от клеточных мембран как внутри, так и вне клетки, наблюдаются периодические механические воздействия и энергичные акустические микропотоки. Напряжения сдвига под влиянием этих микропотоков могут достигать весьма больших величин (102.103 Н/м2), днако уже 10 Н/м2 (5...60 мин воздействия) оказывается достаточно, чтобы уменьшить время жизни эритроцитов и повысить их чувствительность к осмотическому лизису, увеличить проницаемость цитоплазматических мембран и изменить их поверхностную энзиматическую активность, понизить поверхностный заряд и увеличить скорость оседания эритроцитов в поле гравитационных сил.

Переменные напряжения в акустическом поле, расшатывающие структуру клеточной мембраны, и микропотоки, «смывающие» макромолекулы с поверхности клеток, приводят к повышению межфазного натяжения на границе мембрана - среда.

Стремление энергии Гиббса системы к минимуму обусловливает дополнительные напряжения в мембране, приводящие к уменьшению поверхности клетки и снижению се поверхностной энергии. Это повышение напряжения приводит, например, к изменению формы клеток Не La при кратковременном ультразвуковом воздействии (1 Вт/см2; 0,8 МГц; 1 мин), незначительной деформации эритроцитов в сходных условиях и т.д. Оно сохраняется, пока поверхностная энергия не уменьшится до исходных значений в результате адсорбции белка и других поверхностно-активных веществ из окружающей среды.