2.2 Технологічна схема

Існує декілька варіантів отримання вітаміну В12:

1. За допомогою Prop. Freudenreichii.

2. За допомогою Pseudomonas denitricans.

3. За допомогою метаногенних бактерій.

Розглянемо як приклад отримання вітаміна В12 за допомогою пропіоновокислих бактерій.

Для виробництва використовують Prop. Freudenreichii та їх варіанти та мутанти. Найбільш цікавими є штами, здатні до самостійного синтезу 5,6 ДМБ (диметил бензол). Оскільки синтез 5,6 ДМБ проходить краще за наявності повітря, здійснюють процес, що проходить у дві стадії, у якому отримують найбільш високий вихід продукта. На 1-й стадії культуру вирощують в анаеробних умовах до повної утилізації цукру. На 2-1 стадії включають аерацію, тим самим створюючи умови для синтезу 5,6 ДМБ і перетворення етиокобаламіна в деексикобаламін. Обидві стадії здійснюють в двох різних ферментерах, чи в одному. Анаеробно вирощені клітини можна зібрати шляхом центифугування або інкубувати згущену суспензію на повітрі. Додавання ДМБ роблять тільки на 2-й стадії ферментації (якщо бактерії не синтезують його самостійно), оскільки в його присутності утворюються повні форми вітаміну, що інгібують його синтез. Середовище для ферментації зазвичай містить глюкозу або інвертировану мелясу (10-100 мг/л), джерела азоту. В середовище додають кукурудзяний екстракт (30-70 г/л), що містить молочну і пантотенову кислоти, що посилюють ріст бактерій. Ферментацію здійснюють в ферментерах на 500 л, що містить 340 л середовища, інокульованих 7 л посівного матеріалу. В перші 80 год культура росте під невеликим тиском N2 і слабким переміщуванням (без аерації), в наступні 88 год вмикають аерацію (2 м3/год) і перемішування. Можливі декілька варіантів культивування. Вітамін В12 зберігається в клітинах бактерій, тому роблять його екстракцію : 1) виділення вітаміну з клітин і перетворення його в ціанкобаламін, 2) виділення неочищеного продукту (80% чистоти), який можна використовувати у тваринництві, 3) подальшу очистку до рівня 91-98% (для медичних цілей).

Для екстракції вітаміну з клітин останні нагрівають при 80-120° протягом 10-30 хв при рН 6,1-8,5. Перетворення в CN-кобаламін досягають оброботкою гарячого розчину чи клітинної суспензії цианідом чи тіоцианатом, часто в присутності NaNO2 чи хлораміну.

При упарюванні різних розчинників отримують осад чи кристали вітаміну, що розчиняють у відповідному розчиннику до потрібної концентрації. Вихід вітаміну В12 при використанні пропіоновокислих бактерій – 25-40 мг/л.

 Технологічна схема виготовлення кормового концентрату вітаміну В12 метановим бродінням приведена в додатку 1.

Принципово-технологічна схема виготовлення кормового концентрату вітаміну В12 метановим бродінням приведена в додатку 2.

2.3. Біосинтез вітаміну в12 ( продуцент Propionibacterium shermanii)

Кожна вирізнювана в молекулі вітаміну структура: кориноїдне кільце, нуклеотидне ядро і амінопропаноловий  місток – мають своє походження. Механізм їх виникнення – предмет інтенсивних, але ще незавершених досліджень. Перші етапи біогенезу кориноїдів ті ж, що й перші етапи синтезу інших тетрапірольних з'єднань . Загальним інтермедіатом тетрапіролів є ?-амінолевулінова кислота (?-АЛК), що утворюється у більшості організмів в результаті конденсації гліцину і сукциніл-КоА. Однак E. limosum і C. tetanomorphum не включають 2- -гліцин в коринове кільце, що варто було б очікувати, якби гліцин був попередником ?-АЛК. Отже, вже на цьому етапі шлях синтезу вітаміну у бактерій може різнитися . Далі утворюється порфобіліноген, що виникає при конденсації двох молекул ?-АЛК, а при конденсації чотирьох молекул порфобіліногену – уропорфіриноген III (УПГ III). Послідовність реакцій між УПГ III і кобіриновою кислотою отримала експериментальне підтвердження лише в останні роки. Показано, що при порушенні процесу амідування клітини Propionibacterium shermanii виділяють в середовище сполуки, названі коріфіринами – метильовані відновлені похідні уропорфірину III. До теперішнього часу виділено і охарактеризовано три сполуки: коріфірин-1 (метилкоріфірин), коріфірин-2, або сірогідрохлорин (диметилкоріфірин), і коріфірин-3 або, ізобактеріохлорин (три-метилкоріфірин). Мічена ?-АЛК і метіонін включаються в коріфірини, а останні – в вітамін В₁₂. Метилювання УПГ III з одночасним декарбоксилюванням бокового ланцюжка оцтової кислоти при С₁₂ кільця С призводить до розбіжності шляхів біогенезу вітаміну В₁₂ і інших тетрапіролів. В результаті подальшого метилювання та утворення С - С зв'язку між кільцями А і Д синтезується кобіринова кислота. Донором семи метильних груп, що включаються в УПГ III, є S-аденозилметіонін. Характер включення атома Со і утворення безпосереднього зв'язку між кільцями А і Д невідомий. На наступному етапі біосинтетичного шляху кобіринова кислота перетворюється в кобінамід (фактор В), при цьому залишки карбонових кислот кобіринової кислоти амідуються, а до залишку пропіонової кислоти кільця Д приєднується амінопропанол. На цій же стадії відбувається приєднання до коринового кільця 5-дезоксиаденозильної групи і кобіринова кислота стає 5-дезоксиаденозилкобінамідом (коферментна форма фактора В). Амінопропанол, мабуть, утворюється при декарбоксилюванні L-треоніну. Далі кобінамід фосфорилюється з утворенням кобінамідфосфату і, реагуючи з гуанозинтрифосфатом (ГТФ), дає кобінамідгуанозиндифосфат. У коферментну форму кобінамідгуанозиндифосфату відбувається включення нуклеотиду та утворення кобаламін-5'-фосфату. Вітамін В₁₂, як вже зазначалося вище, містить специфічну азотисту основу – 5,6-ДМБ, яка в природі зустрічається тільки в цій сполуці. Безпосереднім попередником 5,6-ДМБ служить рибофлавін. В молекулу вітаміну В₁₂ 5,6-ДМБ включається у вигляді ?-рибазол-5'-фосфату.

При ферментативному дефосфорилюванні кобаламін-5'-фосфату утвориться кобаламін. Послідовність реакцій при синтезі кобаламіну з кобінаміду виглядає наступним чином: 1) кобінамід + АТФ >  кобінамід-Ф + АДФ; 2) кобінамід-Ф + ГТФ >  ГДФ-кобінамід + ФФ_н; 3) кобінамід-ГДФ + ?-рибазол-5'-фосфат  > кобаламін-5'-фосфат + ГМФ; 4) кобаламін-5'-фосфат >  кобаламін + Ф_н.

Відомі дві коферментні  форми вітаміну В₁₂: аденозил-кобаламін (коферментна форма I) (рис. 4) і метилкобаламін (коферментна форма II). Більше 80% всіх синтезованих пропіоновокислими бактеріями кориноїдів знаходяться в коферментній формі I, яка, як уже зазначалося, в якості ліганда містить 5-дезоксиаденозил. Джерелом аденозилу служить  АТФ. Коферментна форма містить  Со-С-зв'язок і є першою кобальторганічною  сполукою, виявленою в живих системах. Метилкобаламін зазвичай міститься  в клітинах в незначних кількостях, але у М. barkeri метил-фактор III, який містить в нуклеотидній частині 5-оксибензімідазол, становить до 80% від суми всіх кориноїдів. Регуляція біосинтезу вітаміну В₁₂ здійснюється за принципом репресії. Вітамін В₁₂ пригнічує тільки свій власний синтез, не справляючи впливу на утворення інших тетрапіролів і, як вважають, діє на стадії метилування УПГ III. В якості регулятора виступає лише повна нуклеотидвмісна молекула вітаміну. Гем надає координовану репресію синтезу ферментів початкових стадій біогенезу тетрапіролів. Функціональною формою вітаміну є аденозилкобаламін (?-(5,6-диметілбензімідазолил)-Со-5-дезоксиаденозилкобамід) (рис. 5) і метилкобаламін (? (5,6-диметилбензімідазолил)-Со-метилкобамід) [2]. Отримання і застосування вітаміну В₁₂

Світова продукція вітаміну В₁₂ становить 9-11 тис. кг в рік, з них 6500 кг використовують на медичні цілі, а іншу частину – для тваринництва. Виробництво вітаміну В₁₂ засновано головним чином на культивуванні пропіоновокис-лих бактерій (в Україні, Великобританії, Угорщині), мезофільних і термофільних меганогенних бактерій (Україна, Угорщина), а також актиноміцетів і споріднених форм (Італія). У нашій країні в якості продуцента вітаміну В₁₂ використовують Propionibacterium freundenreichii var. shermanii. Для отримання вітаміну В₁₂ бактерії культивують періодичним методом в анаеробних умовах в середовищі, що містить кукурудзяний екстракт, глюкозу, солі кобальту і сульфат амонію. Утворені в процесі бродіння кислоти нейтралізують розчином лугу, який безперервно надходить у ферментер. Через 72 години у середовище вносять попередник – 5,6-ДМБ. Без штучного введення 5,6-ДМБ бактерії синтезують фактор В і псевдовітамін В₁₂ (азотистою основою служить аденін), що не мають клінічного значення. Ферментацію закінчують через 72 години. Вітамін В₁₂ зберігається в клітинах бактерій. Тому після закінчення бродіння біомасу сепарують і екстрагують з неї вітамін водою, підкисленою до рН 4,5-5,0 при 85-90° С протягом 60 хв з додаванням в якості стабілізатора 0,25%-ового розчину NaNO₂. При отриманні Ко-В₁₂ стабілізатор не додають.