4. Молекулярно-генетичні методи.

Це велика і різноманітна група методів, для виявлення варіацій в структурі досліджуваної ділянки ДНК (алеля, гена, регіона хромосоми) аж до розшивки певної послідовності основ.

Суттю цих методів є:

1. Використання специфічності роботи ферментів, що розрізають нуклеїнові кислоти.

2. Використання принципу нуклеотидних послідовностей.

3. Вибіркового розмноження (ампліфікація) дволанцюгових ділянок ДНК.

Етапи.

І. Отримання ділянок ДНК. (або РНК.) є початковим етапом усіх методів. Цей етап реалізується у двох варіантах.

а) виділення усієї ДНК. тотальної або геномної із клітини;

б) накопичення певних фрагментів, які необхідно аналізувати за допомогою ПЛР.

Для діагностики хвороби або гетерозигодного стану необхідно обстежити лише невеликий фрагмент генома, тому для проведення аналіза необхідно ампліфікувати (розмножити) велику кількість таких фрагментів.

Помімеразна ланцюгова реакція (ПРЛ) - це метод ампліфікації ДНК. in vitro. Протягом короткого часу можна розмножити певну послідовність ДНК. в мільйон раз. Неоюхідно лише знання нуклеотидної послідовності ампліфікуючого фрагмента.

У відповідності з нуклеотидною послідовністю кінців досліджуваної ділянки сентезуються два олігонуклеотидних праймера (затровка). Довжина праймера- 20-30 нуклеотидів. Процес ампліфікації здійснюється в 3 етапи:

• температурна денатурація ДНК. (розділення двуланцюгової ДНК. на одноланцюгові молекули).

• приєднання праймерів до комплементарних послідовностей одноманцюгових молекул;

• синтиз полінуклеотидних ланцюгів на одноланцюгових молекулах в межах приєднаних праймерів за допомогою полімерази.

  • Рестрикція ДНК. на фрагменти за допомогою рестриктаз (бактеріальні ендонуклеаз) в результаті чого утвориться фрагменти 5-6 пар основ з однаковою послідовністю нуклеотидів різних за розмірами.

  • Електрофорез фрагментів ДНК. в результаті чого ці фрагменти розподіляються на поверхні агарозного або пілікриамідного геля. Фрагменти ДНК. рухаються в гелі, який поміщений в постійне електричне поле, від відємного полюса до позивного в залежності від розмірів чим більша молекулярна маса фрагмента, тим повільніше він рухається в електричному полі.

  • Візуалізація і індетифікація фрагментів ДНК - кінцевий етап діагностики ПЛР. Проводиться електрофорез в агарозному гені, після чого гель обробляється етідія бромідом, який звязується з ДНК.При УФ-опромінені поверхні гелю виявляється світіння в червоному регіоні спектру. Виявлення спецефічних фрагментів ДНК. здійснюється за допомогою блот-гібридизації по Саузенцу. Методику розглянемо на практичних заняттях.

На сучасному етапі застосовується весь спектр параклінічних методів для діагностики спадкових захворювань: клініко-біохімічні, гематологічні, імунологічні, ендокринологічні, електрофізіологічні, рентгенорадіологічні, ультразвукові. Наприклад: при вродженому гіпотиреозі, адреногенітальному синдромі, нанізмі проводять ендокринологічні обстеження; при нервово-м’язевих захворюваннях проводять електрофізіологічні обстеження; для діагностики хондродистрофії, нейрофіброматозу необхідні рентгенорадіологічні обстеження.

Генеалогічний метод - метод родоводів, спостереження хвороби або ознаки в сім'ї, або в родині в ряді поколінь із вказівкою типу родинних зв'язків між членами родоводу. В медичній генетиці цей метод часто називають клініко-генеалогічний, оскільки мова йде про вивчення патологічних ознак в сім'ї з допомогою клінічного обстеження. Генеалогічний метод обстеження дає можливість:

• встановити спадковий характер захворювання;

• тип передачі мутантного гену;

• наявність гетерозиготних носіїв захворювання;

• можливий ризик його прояву у нащадків.

Даний метод найдоступніший для повсякденної практичної роботи і досить інформативний, він є основою для проведення МГК.

Перше завдання при аналізі родоводу - встановлення спадкового характеру хвороби. Якщо в родоводі зустрічається одна і та ж ознака / або хвороба /, то можна думати про його спадкову природу. Однак необхідно виключити можливість фенокопій / ознаку, викликану впливом середовища, з подібною ознакою, що виникла в результаті мутацій /. Наприклад: якщо патогенний фактор діяв на жінку під час вагітності, то у неї можуть народжуватись діти з однаковими природженими вадами або ж одні і ті самі професійні шкідливості можуть викликати подібні захворювання у членів однієї сім'ї.

Після виникнення спадкового характеру ознаки і хвороби /, необхідно встановити тип успадкування. При домінантному типі передачі з повним проявом мутантного гена, проявляється пряма передача хвороби / ознаки / від одного із батьків дітям, причому хворіють особини обох статей.

Якщо захворювання зустрічається у сибсів пробанда, але відсутнє у батьків і дітей, можна думати про рецесивне успадкування.