ХОД РАБОТЫ

*Задание I Определить уровень перекисного гемолиза эритроцитов

1.Приготовить рабочий реактив, pH 7,4. Для этого необходимо смешать 50 мл раствора КФБ, pH 7,4 и 50 мл 17% раствора NaCl. Затем довести объем реактива до 1 л дистиллированной водой. Перед использованием реактив встряхивается для насыщения кислородом 1-2 минуты.

2.К 0,1 мл крови прибавляется 7,5 мл рабочего реактива, проба центрифугируется 10 мин. при 1500 об/мин при 150С.

3.Осадок эритроцитов после декантации надосадочной жидкости ресуспензируется в 7,5 мл рабочего реактива.

4.По 1 мл суспензии эритроцитов разливается в 2 пробирки, содержащие по 4 мл рабочего реактива и в пробирку, содержащую 4 мл дистиллированной воды (холостая проба на 100% гемолиз).

5.Для определения перекисного гемолиза эритроцитов пробы инкубируют при 370С в течение 3 часов с одновременным промежуточным анализом хода перекисного гемолиза эритроцитов через 1 и 2 часа от начала инкубации.

6.После инкубации пробы взбалтываются и центрифугируются (10 мин, 1500 об/мин)

7.Оптическая плотность надосадочной жидкости измеряется на ФЭКе при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против воды.

8.Величина гемолиза рассчитывается по формуле:

% гемолиза = (Е пробы1 + Е пробы 2) ×100 2 ×Е холостой пробы

Примечание: Перекисный гемолиз эритроцитов в норме не превышает 1015%.

*Задание II Определить уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах крови человека

1.Цельную кровь объемом 5мл центрифугируют 15мин при 3000 об/мин.

2.Плазму крови удаляют и добавляют в пробирку физиологический раствор в соотношении с эритроцитарной массой 1:3.

3.Тщательно перемешивают содержимое пробирки и вновь центрифугируют 15мин при 3000 об/мин.

4.Отсосав прозрачный слой физиологического раствора, подобным образом промывают эритроциты трижды.

38

5.Для получения гемолизата эритроцитов (1:10) 0.2 мл эритроцитарной массы вносят в 1.8 мл дистиллированной воды и перемешивают стеклянной палочкой.

6.Опытную и холостую пробы готовят в соответствии с табл. 1:

Таблица 1

7.Пробы перемешивают и выдерживают 5мин при комнатной температуре, затем центрифугируют 15мин при 3000 об/мин, после чего отфильтровывают надосадочную жидкость.

8.Далее к 2.0 мл центрифугата прибавляют 8.0 мл 0.3 M Na2HPO4 и 0.1мл реактива Эллмана.

9.Через 5мин опытную пробу фотометрируют против холостой при длине

волны 412нм.

10.Расчет количества восстановленного глутатиона в эритроцитах производят по калибровочной кривой.

Построение калибровочного графика:

Калибровочный график строится путем введения в методику (пункты 6-9), вместо гемолизата эритроцитов, стандартных растворов восстановленного глутатиона в концентрациях, указанных в табл. 2:

Таблица 2

Примечание: Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крови практически здоровых людей имеет четко выраженную возрастную зависимость.

39