Семенихина и др. (2007)_Современ. методы микробиол. исследований

Это обусловлено рядом обстоятельств: так, вирус гепатита G чаще всего встречается в форме микст-инфекции с НСV; у 2 % клинически здоровых доноров в сыворотке крови определяется РНК вируса гепатита G; до сих пор не уточнено место репликации вируса; не наблюдается корреляция между уровнем вирусемии и активностью АлАТ. Вместе с тем не вызывает сомнения, что выявление НGV-инфекции у пациента является важным фактором в клиническом понимании и оценке статуса больного с ВГ. Повидимому, НGV-инфекция является ко-инфекцией НСV и усугубляет течение последней. В настоящее время серологические методы исследования (ИФА) по отношению к НGV ещё не доступны широкой клинической практике и поэтому метод ПЦР остается единственным способом доказать наличие инфицирования этим вирусом. Мы считаем обязательным обследование на НGV-инфекцию методом ПЦР всех серонегативных больных острым или хроническим ВГ; пациентов с маркерами НСV-инфекции, особенно готовящихся к проведению противовирусной терапии; доноров крови; органы или ткани, предназначенные для трансплантации.

Герпетическая инфекция

Современная таксономия семейства Herpesviridae огромна и включает в себя 80 видов вирусов, которые паразитируют в организмах практически всех существ – от устриц до человека. Герпес-вирусы имеют стабильные родовые свойства, основными из которых являются структура ДНК и механизмы инфицирования клеток хозяина. В настоящее время известно 8 патогенных для человека герпес-вирусов (табл. 10). Герпесвирусная инфекция является наиболее распространённой и может проявляться в разных формах: от пожизненной латентной персистенции до лимфопролиферативных состояний. В связи с этим любая герпес-вирусная инфекция лучше всего характеризуется этим образным выражением: «Однажды инфицирован – инфицирован на всю жизнь». Появляющиеся в ответ на внедрение вирусов герпеса специфические антитела зачастую не обеспечивают санацию организма от вирусов герпеса и не предупреждают рецидива заболевания. В связи с этим перед практикующим врачом стоят задачи: составить наиболее адекватный план лабораторного обследования и правильно оценить полученные результаты. Необходимо помнить, что антитела к большинству герпес-вирусов выявляются более чем у 90 % людей старше 25 лет, не имевших на момент обследования клиники какихлибо герпетических заболеваний. Вместе с тем, как указывалось выше, обнаружение в сыворотке крови ДНК какого-либо из герпес-вирусов не всегда означает дальнейшее развитие клинически манифестной инфекции или является причиной имеющейся патологии. Поэтому врачу крайне важно провести дифференциальную диагностику между состоянием

51

«инфицированности» и «болезни», вызванной каким-либо герпетическим вирусом.

Таблица 10 Классификация герпес-вирусных инфекций человека

С этой целью лабораторные исследования должны проводиться по следующему алгоритму:

–1 этап: тестирование на наличие противогерпетических антител класса М и G методом твердофазного ИФА, а также определение ДНК методом ПЦР (кровь, ликвор, секреты слизистой);

–2 этап: не ранее чем через две, а лучше через три недели повторить обследование методом ИФА на наличие вышеуказанных антител. Проведение ПЦР в этом периоде необходимо только в случае спорной клинической ситуации;

–3 этап: обязательное обследование методом ПЦР для определения ДНК в сыворотке крови, ликворе или другой биологической среде, сроки которого определяются клинически и обычно зависят от протокола лечения. Серологические исследования на данном этапе носят второстепенный характер. Смысл такой последовательности заключается в том, что первые два этапа позволяют установить этиологию и характер инфекционного процесса (острая, хроническая или латентная формы). На третьем этапе врач осуществляет прогноз инфекции, и если назначалось лечение, то оценивает его эффективность. В этой фазе лечебнодиагностического процесса метод ПЦР играет ключевую роль, т. к. уровень специфических антител не отражает степени виремии, а стало быть, прогноз болезни и качество проведенной терапии.

Цитомегаловирус

Цитомегаловирус (ЦМВ) может быть причиной многих серьёзных заболеваний с летальным исходом. Темпы роста заражения ЦМВ составляют 1 % в год, при этом к пятидесятилетнему возрасту инфицированность людей приближается к 100 % показателю. Эти факты не позволяют однозначно ответить на вопрос о степени патогенности вируса. С одной стороны, ЦМВ редко вызывает клинически манифестные заболевания у иммунокомпетентных людей. С другой стороны, у иммунодефицитных пациентов отмечено развитие таких ЦМВ-

52

обусловленных заболеваний, как мононуклеоз (гетерофильнонегативный вариант), хориоретинит, ретардация ментальных функций, глухота и т. п. Как и при любой другой герпетической инфекции при первичном инфицировании ЦМВ возникает пожизненная латенция. Реактивация ЦМВ-инфекции зависит от состояния иммунной системы организма, срыв которой приводит к возможности патологического влияния вируса на организм.

Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекции включает в себя несколько подходов: 1) выявление инфекционных вирусных частиц или антигенов; 2) определение вирусной ДНК; 3) определение иммунного ответа организма; 4) выявление прямого цитопатического действия вируса, выделенного из биологических субстратов пациента, на перевиваемую культуру клеток.

Серологические тесты на ЦМВ являются основными для установления инфицирования данным вирусом. Однако это отнюдь не является основанием для заключения о том, что болезнь действительно вызвана ЦМВ. Показано, что высокие титры анти-ЦМВ-антител обнаружены как у здоровых носителей, так и у больных с острым течением инфекции. Селективное определение специфических антител против ЦМВ класса М и G также не позволяет с полной уверенностью дифференцировать острую инфекцию от реактивации хронической. Поэтому определение вирусных антигенов и ДНК ЦМВ становится важным тестом для диагностики заболевания этим вирусом.

Метод ПЦР широко используется для диагностики ЦМВ в любых биологических тканях и жидкостях, в том числе и биопсийном материале, фиксированном формалином. Этот метод превышает по своей чувствительности все имеющиеся аналоги. Для увеличения диагностической и прогностической значимости разрабатываются количественные методы исследования, создаются праймеры к сверхранним, ранним и поздним генам вируса. Кроме того, апробируются новые технологии ПЦР, основанные на определении РНК-зависимой ДНКполимеразы. Это позволит выявлять мРНК реплицирующегося ЦМВ. Во многих работах показано, что прямая детекция ДНК ЦМВ в плазме методом ПЦР, коррелирует с повышенным риском развития манифестной формы ЦМВ или связанными с ней осложнениями. Кроме того, определение вирусной нагрузки ЦМВ в крови позволяет оценить эффективность противовирусной терапии.

Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ)

Инфекция, названная так в честь учёных Мишеля Эпштейна и Эвелины Барр, выделивших в 1964 г. патоген из опухоли (лимфомы) Беркитта. ВЭБ – широко распространённая инфекция, контаминация которой происходит обычно в молодом возрасте. При этом ВЭБ-инфекция,

53

как и любая герпетическая инфекция, может протекать в форме первичного заражения или реактивации латентного процесса (табл. 11). Как видно из представленной таблицы, ВЭБ – это потенциально онкогенная инфекция.

Таблица 11 Клинические варианты ВЭБ-ассоциированных лимфопролиферативных

заболеваний

Лабораторная диагностика ВЭБ-инфекции базируется на цитологическом исследовании крови или костного мозга, серологических исследованиях (определение гетерофильных и противовирусных антител) и ПЦР. Вирус ЭБ может быть обнаружен методом ПЦР в сыворотке крови, слюне, ткани опухоли и костном мозге. При этом важно сопоставление результатов клинических, серологических и молекулярных обследований в определении ВЭБ-инфекции как причины имеющегося заболевания.

Папиллома-вирусная инфекция человека

HPV-инфекцию начали интенсивно изучать после установления доказательств роли данного вируса в возникновении опухолей аногенитальной области, в частности, рака шейки матки.

HPV – мелкие ДНК-вирусы, особенностью которых является пролиферативное влияние на эпителиоциты кожи и наружных слизистых. В настоящее время известно около 100 типов HPV, различаемых онкогенными свойствами. К группе высокого онкопотенциала относят следующие типы вирусов папилломы: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. К типам с низкими предиктами онкогенности относят варианты: 6, 11, 42, 43 и 44. В таблице 12 представлены основные типы НРV и характерные для них клинические проявления. В лабораторной диагностике НРV-инфекции применяются исключительно молекулярногенетические методы анализа. Использование метода ПЦР для выявления папилломатоза резко повышает уровень доклинической диагностики предраковых состояний, благодаря высочайшей чувствительности и предсказательной ценности типирования вируса. Проведенные эпидемиологические исследования в Европе и Северной Америке показали, что при всех формах инвазивного рака матки у 70 % женщин старше 35 лет с дисплазией клеток эпителия матки был выявлен вирус

54

папилломы, преимущественно 16 и 18 типов. При обследовании женщин с нормальной цитологией НРV обнаруживался только в 3,5 % случаях.

Таблица 12 Типы HPV, обнаруженные при различных поражениях кожи и слизистых

оболочек

Таким образом, метод ПЦР в профилактике (доклинической диагностике) онкологических заболеваний аногенитальной области папилломатозной этиологии не имеет себе равных.

Хламидиозная инфекция

Хламидии относятся к классу Rickettsias и включают одно семейство Сhlamydiaceae с единственным родом Chlamydia. В настоящее время известны три видовых таксона: C. Trachomatis, C. Psittaci и C. Pneumoniae.

Наибольший удельный вес имеют генитальные формы, которые вызываются C. Trachomatis. По данным специалистов ВОЗ, ежегодно у около 50 млн человек впервые диагностируется генитальный хламидиоз.

Экологической нишей хламидийной инфекции является цилиндрический эпителий шейки матки, уретра и прямая кишка. Полагают, что около 10 % всех женщин и мужчин инфицированы C. Trachomatis, при этом у пациентов хламидиоз протекает бессимптомно.

55

Вместе с тем, хламидии могут вызывать тяжелые заболевания, характеризующиеся как хронические воспаления малого таза, приводящие к бесплодию (женскому и мужскому) и другим последствиям. Для диагностики хламидиозной инфекции используют прямые (культуральные и молекулярно-генетические) и косвенные (определение специфических антител) методы диагностики. Наиболее доступным и эффективным является метод ПЦР.

Микоплазменная инфекция

Микоплазмы представляют собой мельчайшие бактерии, лишённые жесткой клеточной стенки. Последнее обстоятельство позволяет относить их, наряду с хламидиями, риккетсиями, актиномицетами и спирохетами, к

M. Hominis и U. Urealyticum, вызывающие урогенитальные заболевания мужчин и женщин. Клинические проявления микоплазменной инфекции весьма разнообразны и зависят от вида возбудителя и состояния макроорганизма: от латентной инфекции до менингита новорожденных, артрита (синдром Рейтера) или бесплодия. Различают острый, подострый, вялотекущий и хронический микоплазмоз. Лабораторная диагностика микоплазмозов без использования метода ПЦР сложна. До внедрения молекулярно-диагностических способов диагностики лабораторная верификация любой формы микоплазменной инфекции строилась на малодоступном методе выделения чистой культуры и серологическом обследовании на наличие специфических антител. Это связано с тем, что до 80 % здоровых людей имеют антитела к микоплазме и только нарастание титра антител в 4 раза является диагностически значимым. Основными преимуществами метода ПЦР в лабораторной диагностике микоплазмоза являются: высокая чувствительность, что особенно важно при хронических и подвергшихся лечению формах инфекции; высокая

56

специфичность; менее строгие требования к забору и транспортировке материала; возможность быстрого получения результатов анализа.

Хеликобактерная инфекция

В 1983 г. совершенно случайно из архивного эндоскопического биоптата микробиологами Маршаллом и Уорреном была выделена чистая культура Helicobacter pylori. Данный возбудитель – типичный антропоноз, экологической средой обитания которого является слизистая желудка, на которой H. Pylori может длительно (возможно, пожизненно) персистировать, не вызывая болезнь. Основными доказательствами этиопатогенетической значимости H. Pylori в возникновении и развитии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки являются следующие факты:

–у больных с язвой двенадцатиперстной кишки и желудка статистически достоверно на 85–90 % чаще выявляются маркеры хеликобактерной инфекции;

–у лиц, заражённых H. Pylori, язвенная болезнь развивается достоверно чаще, чем у лиц без данного патогена;

–эрадикация с помощью антибиотиков H. Pylori позволяет излечить язвенную болезнь.

Лабораторная диагностика хеликобактерной инфекции строится на следующих критериях:

1.Получение чистой культуры H. Pylori из эндоскопического материала и определение ее токсичности.

2.Микроскопия отпечатков биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.

3.Определение уреазной активности в биопсийном материале или в содержимом желудка (респираторный тест).

4.Серологический тест на обнаружение антител к хеликобактеру.

5.Метод ПЦР для выявления ДНК в эндоскопическом биоптате. ПЦР в этом ряду диагностических тестов имеет одно неоспоримое

преимущество. Вследствие своей высокой чувствительности данный метод позволяет точно определить присутствие H. Pylori и ее способность к токсинообразованию (т. е. патогенность) и оценить эффективность проведенной терапии.

Туберкулез

Туберкулёз по-прежнему остается проблемой всеобщего масштаба. Это обусловлено целым рядом социально-экономических (бедность, недоступность медицинской помощи, предрассудки и т. п.) и медицинских (прежде всего эпидемией ВИЧ-инфекции) причин. По данным ВОЗ, от туберкулёза ежегодно умирает около 3 млн человек. Для лабораторной диагностики туберкулёза используется комплексный подход, который

57

включает в себя специфические и неспецифические методы. Специфические методы лабораторной верификации туберкулёза состоят из четырёх этапов: бактериологический; молекулярно-генетический; цитогистологический; иммунологический.

Внедрение в практическую фтизиатрию молекулярно-генетических методов обследования стало решительным прорывом в диагностике различных форм туберкулёза. Применение ПЦР как главного молекулярно-генетического метода исследования позволяет в короткие сроки (до 48 часов) выявить микобактерии в любом биологическом материале. Это особенно важно, т. к. микобактерии отличаются замедленным ростом при культивировании на питательных средах. Так, аналитическая чувствительность коммерческих амплификационных тестсистем позволяет идентифицировать единичные колонии (до 10 клеток). Метод ПЦР позволяет избирательно проводить амплификацию фрагментов НК микобактерий, что позволяет добиться 100 % специфичности и 97 % чувствительности анализа.

Кроме того, необходимо отметить ещё два достоинства метода ПЦР. Во-первых, возможность определения внелегочных форм. Во-вторых, идентификация химиорезистентности микобактерий, что резко повышает эффективность терапии. Таким образом, метод ПЦР позволяет на 30 % повысить выявляемость микобактерий туберкулёза при значительном (в 10 раз) сокращении времени исследования.

Методы молекулярного типирования микроорганизмов на основе ПЦР

ПЦР широко используется не только для диагностики и идентификации, но также и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием) генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. Описано много методов генотипирования, которые можно рассматривать как производные технологии ПЦР (табл. 13). На практике выбор определенного метода типирования зависит от характера и целей проводимого эпидемиологического исследования с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации, необходимости сравнения результатов с данными, полученными из других источников, а также от возможностей конкретной лаборатории.

58

Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК разной длины, полученных от каждого отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов.

Таблица 13 Наиболее распространенные методы генетического типирования

микроорганизмов с использованием ПЦР

59

Использование ПЦР для выявления лекарственной устойчивости у микроорганизмов

В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов является целесообразным лишь в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 недель. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости M. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности (табл. 14).

Таблица 14 Примеры использования ПЦР для выявления резистентности

к антимикробным препаратам у различных видов микроорганизмов

60