Семенихина и др. (2007)_Современ. методы микробиол. исследований

Несмотря на вышеуказанные достоинства, метод ПЦР все же не лишен некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований. В настоящее время выделяют следующие недостатки.

Один из них– технологический. Метод ПЦР подразумевает под собой высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тестнаборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР, государственный сертификат.

Второй недостаток – клинический, заключающийся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40 % – 60 % лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий – «инфицированность» и «инфекционная болезнь».

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.

Возможности применения метода ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний

В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров,

комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦРамплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых

41

образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления

C. trachomatis.

Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR).

Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (C. trachomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта)

или даже четырех возбудителей (H. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis

и A. otitidis при хроническом гнойном отите).

Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических микроорганизмов.

Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных методов с целью идентификации бактерий, которым они принадлежат. Наиболее точным методом «молекулярной» идентификации является определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов.

Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих описанный принцип идентификации, на практике обычно используются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые тем не менее позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами (метод ПДРФ (RFLP) –

полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), или на определении

42

электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод

SSCP – одноцепочечный конформационный полиморфизм).

ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует однако отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов.

Использование ПЦР для прямой диагностики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний

В данном разделе будут рассмотрены только некоторые виды патологии, при которых метод ПЦР является основой диагностики и критерием эффективности лечения.

ВИЧ-инфекция

Этиологическим фактором ВИЧ-инфекции являются вирусы HIV-1 и HIV-2 (от англ. Human Immunodeficiency Viruses) из семейства Retroviridae.

Патогенез ВИЧ-инфекции заключен в инфицировании вирусом клеток с фенотипом CD-4, присущим Т-лифоцитам хелперам и некоторым другим клеткам организма человека. Прямое цитопатическое воздействие, оказываемое вирусом иммунодефицита на указанные клетки, в конечном итоге приводит к летальному исходу за счет активации оппортунистических инфекций или развития опухолей.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции проводится в трёх направлениях:

1.Серологическая диагностика маркеров вируса методами иммуноферментного анализа и иммуноблотинга, заключающаяся в определении в сыворотки крови антигенов и антител против ВИЧ.

2.Определение вирусной НК (провирусной-ДНК или РНК) методом ПЦР как в крови, так и в клетках крови.

3.Исследование иммунного статуса (количественная оценка CD-4 лимфоцитов), которая наиболее адекватно осуществляется методом проточной цитофлюориметрии.

Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике ВИЧинфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика ВИЧ-инфекции

удетей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребёнок, родившийся от ВИЧ-инфицированной матери, обязательно имеет антитела к вирусу иммунодефицита. Различить

43

у ребенка материнские и его собственные антитела к ВИЧ не представляется возможным. У неинфицированного ребёнка данные антитела элиминируются под влиянием собственной иммунной системы к возрасту 6–9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни, но не более этого срока. Необходимо отметить, что обследование методом ПЦР имеет смысл только при полном отказе от грудного вскармливания ребёнка ВИЧ-позитивной матерью с момента рождения, т. к. риск заражения довольно высок и составляет около 5 %. Таким образом, ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей раннего возраста. Так, если имеет место положительный результат ПЦР на НК вируса иммунодефицита в первые 48 часов жизни, то ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если в первые 48 часов имеет место отрицательный результат ПЦР, но он становится положительным в возрасте 7–14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum. В настоящее время ПЦР позволяет осуществлять не только диагностику, но и мониторинг лечения ВИЧ-инфекции путем определения концентрации РНК в плазме, а также выявления резистентных к химиотерапии штаммов вируса иммунодефицита. Определение «вирусной нагрузки» в плазме крови является наилучшим прогностическим критерием течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности антиретровирусной терапии. Таким образом, в настоящее время метод ПЦР является основным лабораторным критерием диагностики, прогноза и оценки эффективности лечения ВИЧ-инфекции.

Вирусные гепатиты

Современная таксономия вирусов гепатита человека представлена (табл. 8) семью типами возбудителей: А, В, С, D, Е, G и TTV. Для каждого вида возбудителя разработаны амплификационные тест-системы, но наиболее ценным метод ПЦР оказался в диагностике вирусов гепатита В, С, D, G и TTV. Это обусловлено тем, что именно указанные возбудители больше всего ответственны за летальные, хронические и неопластические исходы вирусных гепатитов у людей. В патогенезе ВГ решающую роль играют свойства вируса и генетически детерминированный характер иммунного ответа на этот возбудитель, поэтому не менее важна оценка иммунитета (определение CD-4, CD-8, CD-56 и других фенотипов уровня интерферонов). Как указывалось выше, наиболее точные оценки иммунного статуса получаются при использовании метода проточной цитофлюориметрии.

44

Рис. 9. Примерный серологический профиль, характерный для острого вирусного гепатита В с благоприятным исходом

Рис. 10. Примерный серологический профиль, характерный для хронического гепатита В, вызванного вирусом дикого типа

Особенностью HBV-инфекции является наличие феномена так называемого «здорового» носительства НВsAg. Считается, что «здоровое» носительство НвsAg есть интегративная форма хронической HBVинфекции. Механизм этого феномена заключен в способности вируса гепатита В встраиваться в геном гепатоцита человека. При этом интеграция ДНК вируса в хромосому гепатоцита происходит не в полном объеме (дискретно), что приводит к синтезу только отдельных антигенов, в частности, НВsAg. Интересно отметить, что интегрированная ДНК вируса выявлялась в биоптатах печени у широкого круга лиц от абсолютно здоровых людей до пациентов с первичной гепатомой. В данной ситуации метод ПЦР позволяет дифференцировать интегративную и репликативную формы HBV-инфекции (табл. 9). Это имеет крайне важное клиническое значение, т. к. при интегративной форме HBV-инфекции человек незаразен для окружающих (отсутствует риск вертикальной передачи вируса от матери к плоду, возможность заражения для полового партнёра; человек по-прежнему сохраняет профессиональную пригодность и т. п.). Кроме того, таким пациентам не показана противовирусная терапия, более того, она для них даже опасна. Вместе с тем, при интегративной форме инфекции резко возрастает вероятность развития гепатомы (в 200 раз выше, чем у лиц без маркеров HBV-инфекции). Таким людям необходимо не менее одного раза в год проходить комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включающее в себя осмотр врача, печеночный комплекс, определение альфа-фетопротеина, ДНК HBV,

46

сонографию печени. Метод ПЦР имеет еще одно немаловажное клиническое значение: он может выступать в качестве арбитра для определения необходимости старта лечения и контроля эффективности терапии. Быстрое и стойкое исчезновение из крови ДНК НВV является прямым и надёжным тестом успешного исхода противовирусного лечения.

Таблица 9 Маркеры вируса В в репликативную и интегративную фазы развития

HBV-инфекции

Таким образом, определение ДНК НВV в плазме крови является важнейшим анализом, который в совокупности с другими лабораторными исследованиями позволяет объективно диагностировать инфекцию, определять характер инфекционного процесса, выступать в качестве критерия в проведении терапии и оценки её эффективности.

Вирусный гепатит C

Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae и был идентифицирован в 1989 году как главный этиологический фактор посттрансфузионных гепатитов у людей. С открытием НСV (от англ. Hepatitus C Virus) начался процесс кардинального пересмотра этиопатогенеза и лечения хронических аутоиммунных гепатитов и криптогенных циррозов печени. По данным ВОЗ, около 3 % мирового населения инфицированы НСV. При этом ежегодно в мире регистрируется более одного миллиона новых случаев НСV-инфекции, что соответствует уровню пандемии. Особенностями НСV-инфекции является высокая частота хронизации (от 30 % до 95 % в зависимости от генотипа вируса), длительное бессимптомное или мимикрирующее под другие болезни

47

течение, возможность трансплацентарной и сексуальной передачи инфекции (рис. 11).

На рисунке 12 представлен алгоритм обследования пациента на НСV-инфекцию. Необходимо помнить, что у пациентов, инфицированных вирусом гепатита С, возможны несовпадения результатов определения антител и РНК вируса.

Ложноотрицательные результаты в ИФА при положительной ПЦР имеют место в следующих ситуациях.

1.Исследование произведено в ранние сроки после заражения или в так называемую фазу «серологического окна», которая длится от 2 недель до 6 месяцев. Это является основной причиной того, что методами ИФА в сыворотке крови не всегда удается обнаружить антитела против вируса гепатита С.

2.У иммуносупрессивных пациентов, в частности у ВИЧинфицированных, онкологических и туберкулёзных больных.

3.При инфицировании редкими генотипами НСV-инфекции, например 4 и 5 субтипами вируса С.

Негативная ПЦР при положительном ответе в ИФА чаще всего бывает вследствие низкой концентрации вируса в крови (порог аналитической чувствительности) или при действительной элиминации патогена из организма, но при этом антитела к вирусу гепатита С ещё могут циркулировать в крови до двух лет. В целом необходимо помнить, что серологическая диагностика НСV-инфекции, т. е. выявление специфических антител класса M и G, решает задачу этиологического диагноза ВГ, но не определяет характер и прогноз инфекционного процесса. Более того, тест-систем ИФА для практического

48

здравоохранения с целью определения антигенов вируса гепатита С вообще не существует.

Таким образом, применение ПЦР позволяет выявлять вирус гепатита С на самом раннем этапе инфекционного процесса, поскольку РНК вируса гепатита С может обнаруживаться в сыворотке крови уже через неделю после инфицирования. Ещё одной уникальной возможностью метода ПЦР является определение генетической полиморфности вируса гепатита С. В настоящее время выделяют 6 основных генотипов вируса гепатита С, которые в свою очередь делятся на множество субтипов. В странах СНГ преобладающими являются 1, 2 и 3 генотипы ВГС, причем наличие субтипа 1b является наименее благоприятным признаком течения и успешной терапии НСV-инфекции. Метод ПЦР позволяет также определить перинатальное заражение ребёнка от НСV-инфицированной матери.

Таким образом, в диагностике, оценке прогноза и успеха противовирусной терапии НСV-инфекции метод ПЦР не имеет себе равных.

Вирусный гепатит D

Вирус гепатита D является уникальным патогеном, занимающим промежуточное положение между вирусами и вириоидами, и классифицируется как рибозим. Вирус гепатита D был открыт в 1977 г. итальянским микробиологом Ризетто у больного хроническим вирусным гепатитом В. В начале его расценили как новый антиген НВV и обозначили согласно английскому алфавиту буквой «d» или HВdAg, т. е. вслед за HВcAg. Поcледующие исследования показали, что это самостоятельный вирус, а после открытия нового возбудителя гепатитов (НСV-инфекции) сложившуюся классификацию решили не менять. Вирус гепатита D является «дефектным», что обусловлено отсутствием собственной оболочки вокруг вирусной РНК. Для этой цели вирус гепатита D использует НВsAg, посредством которого и происходит адгезия к мембране гепатоцита.

Рис. 13. Примерный серологический профиль, характерный для коинфекции вирусами D и В

49

Рис. 14. Примерный серологический профиль, характерный для суперинфекции вирусом D у больного хроническим вирусным гепатитом

В

Таким образом, НDV – это всегда микст-инфекция с HBV, которая может быть в форме коинфекции (одновременное заражение вирусами гепатита В и D) (рис. 13) или суперинфекции (на фоне хронической моно- HBV-инфекции происходит заражение НDV) (рис. 14). Поэтому эпидемиология, клиника, лечение, диагностика и профилактика HBV соответствует НDV. Лабораторное обследование на наличие вируса гепатита D обязательно для всех пациентов только после обнаружения маркеров HBV-инфекции. Необходимо помнить, что серологический спектр маркеров HBV-инфекции зачастую обеднён, что обусловлено феноменом вирусной интерференции (ингибиция репликации вируса гепатита В вирусом гепатита D). При всех вариантах течения НDV-инфекции (коили супер-) метод ПЦР позволяет определить вирусную РНК в сыворотке крови пациента. Поэтому данный метод исследования может использоваться для контроля эффективности терапии и прогноза течения и исхода болезни. Клинически важно определить имеющуюся микст-инфекцию гепатитов В и D, так как это определяет прогноз течения и исхода вирусного гепатита. НDV усиливает некротический эффект при HBV, а стало быть, повышает риск развития.

Вирусный гепатит G

Открытие вируса гепатита G (ВГG) в 1995 г. явилось следствием попыток ответить на вопрос, почему до 1/3 парентеральных ВГ оставались серологически недифференцированными. ВГG – это РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae. В настоящее время доказано генетическое разнообразие вируса, имеющего 5 генотипов. Этот факт необходимо учитывать для правильной клинической трактовки результатов исследований. ВГG протекает чаще всего в иннапарантных или субклинических формах, что приближает его к НСV-инфекции. Хотя данный вирус выделен из крови и биоптатов печени больных хроническим гепатитом, что практически доказывает патогенность вируса, имеющиеся в настоящее время факты заставляют некоторых гепатологов критически относиться к способности НGV-инфекции вызывать поражения печени.

50