Семенихина и др. (2007)_Современ. методы микробиол. исследований

является следствием безуспешного лечения, приводящего к рецидивам заболевания. Для диагностики лямблиоза используют определение в кале методом ИФА специфического антигена GSA 65, продуцируемого в больших количествах во время размножения Giardia lamblia в кишечнике хозяина. GSA 65 является специфическим антигеном Giardia и не обладает перекрестной реактивностью по отношению к другим кишечным паразитам. В сыворотке крови инвазированных лямблиями людей выявляются антитела к антигенам лямблий, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов. Показано, что попадание антигенов лямблий в периферическую кровь увеличивается при резорбции слизистой оболочки кишечника. В связи с этим выявление IgМ к специфическим антигенам лямблий в сыворотке крови может свидетельствовать о наличии острого лямблиоза, диагностика которого возможна на 10–14 день от начала инвазии.

Токсоплазмоз

Паразитарное заболевание, характеризующееся полиморфизмом клинических проявлений и значительной вариабельностью течения процесса: встречаются как и здоровые носители, так и лица с тяжелой, летальной формой болезни. Поражается в основном нервная система, мышцы, миокард, глаза, увеличивается печень и селезенка. Для лабораторной диагностики токсоплазмоза используют комплексное определение специфических IgM и IgG . Наличие IgM-антител к токсоплазме является показателем острого токсоплазмоза. Однако для подтверждения положительного результата рекомендуются дальнейшие лабораторные исследования. Отрицательные результаты анализа не исключают возможности ранней стадии заболевания с низкими концентрациями специфических IgM. Для диагностики недавнего инфицирования рекомендуется проводить два взятия крови у пациента с интервалом три недели – важным признаком недавнего инфицирования является нарастание титра специфических IgG.

Описторхоз

Описторхозы – гельминтозоонозы, вызываемые различными трематодами, характеризующиеся хроническим течением с преимущественным поражением печени, желчного пузыря и поджелудочной железы. Механизм патологического влияния описторхозов на организм человека складывается, в основном, из трех моментов: сенсибилизация организма к антигенам паразита с последующим развитием аллергических реакций; воздействие продуктов жизнедеятельности паразита на организм человека; повреждение органов и тканей человека в месте обитания паразита.

Описторхоз вызывает значительные изменения в гепатобиллиарной системе, что ведет, в свою очередь, к возникновению различных форм

31

панкреатита, раку печени и поджелудочной железы. В случае интенсивного распада гельминтов могут развиться тяжелые проявления аллергии по типу реакции немедленного типа. Обнаружение специфических антител подтверждает диагноз описторхоза. Восприимчивость человека высокая. Иммунитет после перенесенного заболевания нестойкий.

Токсокароз

Токсокароз – заболевание человека, вызываемое миграцией личинок гельминтов, поражающих главным образом представителей псовых

(Toxocara canis) и семейства кошачих (Toxocara mystax). Человек для токсокар не является истинным хозяином, поэтому личинки паразита в его организме не достигают половой зрелости, однако они способны к длительной миграции, поражая различные органы и ткани. Прижизненный паразитологический диагноз токсокароза практически невозможен, поскольку обнаружить мигрирующие личинки трудно, а идентифицировать их по гистологическим срезам весьма непросто. Ограниченная возможность паразитологической диагностики приводит к тому, что ведущими в диагностике токсокароза являются иммунологические тесты.

Диагностика аллергических и иммунопатологических состояний Ревматоидный фактор

Определение РФ в периферической крови человека методом ИФА используется для обследования пациентов с подозрением на ревматоидный артрит для мониторинга и контроля эффективности проводимых лечебных мероприятий. Установлено, что высокий уровень РФ коррелирует с более тяжелым течением ревматоидного артрита и наличием системных (внесуставных) проявлений. Учитывая воспалительный характер ревматоидного артрита, для мониторинга заболевания и эффективности терапии помимо определения РФ целесообразно количественное определение С-реактивного белка. Ревматоидный фактор может обнаруживаться в крови человека при хронических гепатитах В и С; различных вирусных инфекциях; некоторых видах лимфом; системной красной волчанке; склеродермите; саркоидозах.

Иммуноглобулин Е

IgE отличается от других иммуноглобулинов высокой цитофильностью, т. е. способностью присоединяться к клеткам, в частности к тучным клеткам и базофилам. Присоединение антигена к IgE, находящемуся на этих клетках, приводит к выделению гистамина и других активных субстанций, обеспечивающих развитие реакций гиперчувствительности немедленного типа. Особенностью IgE является

32

неспособность преципитировать антигены in vitro и фиксировать комплемент при его активации по классическому пути. IgE не способен проникать через плаценту. Определение IgE в клинике является показательным при диагностике различных аллергических состояний. IgE весьма чувствителен к нагреванию и другим денатурирующим воздействиям.

У больных с атоническими аллергиями (например, внешней астмой, сенной лихорадкой или атомической экземой) уровень IgE в крови значительно повышен. Количество IgE увеличено также при многих паразитических заболеваниях. Концентрация IgE зависит от длительности заболевания, поэтому короткие атопические приступы не вызывают ее повышения. Иммуноферментный метод определения IgE является прекрасным вспомогательным средством диагностики атопической аллергии, клинически проявляющейся в виде астмы, частых заболеваний дыхательных путей, хронического ринита или дерматита. Определение IgE является полезным для прогнозирования наследственных аллергических заболеваний у детей.

Повышение уровня IgE происходит при некоторых прогрессирующих опухолях, некоторых случаях агаммаглобулинемии (врожденная сцепленная с полом и обычная форма).

Методы ИФА также широко используются для оценки уровня других иммуноглобулинов крови в рамках определения иммунного статуса пациентов.

33

ТЕМА 2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ Применение метода полимеразной цепной реакции

в медицинской микробиологии

Молекулярная клиническая диагностика – наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает в себя определение генов и продуктов их деятельности – протеинов и нуклеиновых кислот. Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 70-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии. Этому способствовало, во-первых, создание моноклональных антител, взаимодействующих только с определёнными эпитопами (антигенными детерминантами); во-вторых, изобретение метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотт), названного так по фамилии учёного, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК). И, наконец, ещё одним «критическим» научным событием стало открытие в 1985 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики.

В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту – уровень определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР теоретически может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК. В связи с этим возникает один немаловажный вопрос, принципиальный для инфектологии: насколько тождественны понятия «НК» и «возбудитель». С точки зрения общей микробиологии, это неравнозначные понятия, т. к. возбудитель – это сложная биологическая система, включающая в себя НК, цитоплазму, оболочку и продукты жизнедеятельности микроорганизма. Но при этом НК не может обойтись вне этой сложной структуры, как и сам патоген не может существовать без НК. Поэтому с позиции клинической медицины определение НК является эквивалентом обнаружения/необнаружения возбудителя в объекте исследования.

Внедрение в практику этого метода наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток.

Традиционный для микробиологических лабораторий культуральный метод диагностики, как правило, хорошо оправдывает себя

34

для выявления и исследования таких свойств, как чувствительность к антибиотикам, вирулентность легкокультивируемых микроорганизмов. Однако некоторые микроорганизмы (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) могут быть чрезвычайно чувствительными к условиям забора клинического материала, транспортировки и культивирования, наличию специальных факторов роста или способны к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии).

Медленный рост на искусственных средах таких микроорганизмов, как микобактерии и грибы, является еще одним естественным ограничением, связанным с использованием культурального метода для диагностики этих микроорганизмов. Кроме того, работа с живыми культурами выделенных возбудителей, причем не только особо опасных, но иногда и условно-патогенных, может представлять угрозу для здоровья персонала лаборатории.

Среди возбудителей болезней человека известны также и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита C, попытки выращивания которых в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов.

Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов, таких, как выявление специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.

В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров,

комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦРамплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции

35

позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах [5]. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления

C. trachomatis.

Принцип метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (рис. 8). Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНКполимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Для начала синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе необходима РНК-затравка (праймер), к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной

комплементарности.

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:

1)денатурации, или «плавления» ДНК, когда двухцепочечная ДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние;

2)связывания (отжига) праймеров с матричной ДНК;

3)элонгации, или удлинения цепи.

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси (рис. 8.1). Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле, т. е. растет с числом циклов экспоненциально.

36

В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taqполимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.

Для осуществления ПЦР в основном используются приборы (термоциклеры), которые изменяют температуру автоматически на основе заданной программы. В термоциклерах пробирки с реакционной смесью помещаются в металлический блок, температура которого изменяется с помощью элемента Пельтье. Элемент Пельтье позволяет изменять температуру блока с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.

Современные термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостенных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции.

Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1–3 ч. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.

Параллельно с усовершенствованием технологии ПЦР развивались и методы анализа продуктов реакции. Метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием, традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера.

Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности автоматизации для анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все более распространенным. В некоторых случаях применение специальных флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение амплификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредственно в реакционной пробирке.

37

Плавление (денатурация) двухцепочечной ДНК

Отжиг

праймеров

Синтез новых цепей ДНК

1-й цикл → 2-й цикл

→ N-й цикл

Х*(2N-2N) копий

Х- количество копий ДНКмишени перед началом реакции

Рис. 8. Механизм полимеразной цепной реакции: основные этапы цикла ПЦР и процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов

38

Рис. 8. Механизм полимеразной цепной реакции: основные этапы цикла ПЦР и процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов

Преимущества ПЦР как метода диагностики

Одним из критериев диагностической эффективности любого лабораторного анализа является показатель чувствительности. При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов – г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем – диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.

Второй универсальный критерий лабораторной эффективности – специфичность – определяется процентом здоровых людей, имеющих истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99–100 %.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят таковые, обеспечиваемые культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня, при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться) в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных методов диагностики показала, что «быстрые» или экспресс-тесты, имеют чувствительность 40–60 %, ИФА – 50–70 %, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) – 55–75 %, культуральное исследование – 60–80 %, а ПЦР – от 90 до 100 %.

Как видно, ПЦР, по сравнению с другими способами, обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и

39

непродолжительностью по времени анализа, т. е. «актуальностью» получения результата исследования врачом и пациентом.

Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики.

1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.

2.Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.

3.Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.

4.Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяет получить результаты исследования в руки врача и пациента в день проведения анализа.

5.Возможность доклинической и ретроспективной диагностики

ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т. е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

6.Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы

(до нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т. п.

7.Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата.

8.Возможность экспертизы. Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.

40