Микра / Занятия / 2. Методы исследования морфологии бактерий

ЗАНЯТИЕ № 2

ТЕМА: МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Защитные приспособления у микроорганизмов. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение.

2. Капсулы бактерий, их значение.

3. Жгутики, их строение. Реснички. Секс-пили.

4. Сложные способы окраски. Техника окраски по Граму, Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Нейссеру.

5. Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии. КОН-тест. Принцип метода.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Техника окраски по Граму (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания по методу Грама/ раскрасить таблицу)

Этап окраски	Грамположительные бактерии	Грамотрицательные бактерии
1. Окрашивание генцианвиолетом (генциановым фиолетовым) (время экспозиции 1минута )
2. Обработка раствором Люголя (время экспозиции 1минута ))
3. Обработка 96% спиртом (время экспозиции 1минута )
4. Окрашивание водным фуксином или сафранином (время экспозиции 2 минуты ))

Основные морфологические группы бактерий (изобразите в виде цветных рисунков в соответствии с окраской по Граму):

КОККИ
Диплококки	Стрептококки		Стафилококки		Сарцины
ПАЛОЧКИ
Бактерии	Бациллы		Стрептобациллы		Клостридии
ИЗВИТЫЕ ФОРМЫ
Вибрионы		Спириллы		Спирохеты

1►Окраска по Граму мазков из бульонной культуры стафилококка, агаровой культуры кишечной палочки и их смеси. Зарисовка препаратов.

Смесь бактерий (Staphylococcus aureus, Escherichia coli) Окраска по Граму Увеличение x 630

2►Приготовление мазка из культуры дифтерийной палочки, окраска метиленовым синим по Леффлеру и по Нейссеру. Зарисовка препаратов.

Corynebacterium diphtheriae Окраска по Леффлеру Увеличение x 630

Corynebacterium diphtheriae Окраска по Нейссеру Увеличение x 630

3►Постановка и учет результатов КОН-теста с культурами золотистого стафилококка и кишечной палочки.

Результат КОН-теста (с 3% раствором) Staphylococcus aureus стенка не разрушается, Escherichia coli стенка разрушается образуются тянущиеся за петлей слизистые нити .

ДЕМОНСТРАЦИИ

C.diphtheriae	Bordetella	Escherichia coli	B. anthracis
окраска метиленовым синим по Леффлеру	окраска по Граму	окраска по Граму	окраска по Граму
Палочки неправильной формы, беспорядочно, «римские V и X»	Коккобактерии – слегка вытянутые палочки	Палочки с закругленными концами	Стрептобациллы, образующие в организме капсулу

(указать методы окраски микроскопических препаратов и особенности морфологии микроорганизмов – форму и расположение в препарате)

4►Приготовление мазка из агаровой культуры спороносных бацилл, окраска по Цилю-Нельсену (или по методу Ожешко), микроскопия и зарисовка.

Техника окраски по Цилю-Нельсену (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания/ раскрасить таблицу)

Этап окраски	Окраска спор по Ожешко На нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р HСl и подогревают 1-2 минуты над рламенем, промывают водой, фиксируют и далее см. ниже	Окраска кислото-устойчивых бактерий
1. Обработка на мазок наносят фильтровальную бумагу наливают карболовый фуксин Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров (время экспозиции до отхождения паров ) Также необходимо снять бумажку, остудить препарат, сполоснуть водой
2 !. Обработка 5% раствором H2SO4 Концентрация 5%
3. Окрашивание водным раствором метиленового синего (время экспозиции) 3-5 минут

* МТ – Mycobacterium tuberculosis; Str – стрептококк.

5►Микроскопия препаратов микроорганизмов, окрашенных по Цилю-Нельсену. Зарисовка препаратов.

Bacillus anthracoides Окраска по Цилю-Нельсену. Увеличение x 630

Mycobacterium tuberculosis в мокроте Окраска по Цилю-Нельсену. Увеличение x 630

6►Приготовление мазка из агаровой культуры палочки риносклеромы, окраска по Бурри-Гинсу, микроскопия и зарисовка.

Klebsiella rhinoscleromatis Окраска по по Бурри-Гинсу Увеличение x 630

7►Приготовление препарата «раздавленная капля» или «висячая капля» из сенного настоя для изучения подвижности (указать особенности микроскопии препарата)

1 этап

2 этап

3 этап

1. Нанесение взвеси микроорганизмов на покровное стекло;

2. Смазывание краев лунки на предметном стекле вазелином и помещение покровного стекла на предметное стекло; 3)Готовый препарат, микроскопируют с иммерсионным обьективом

Бакте́рии (др.-греч. βακτήριον — палочка) — группа (царство) прокариотных (безъядерных) микроорганизмов, чаще всего одноклеточных. К настоящему времени описано около десяти тысяч видов бактерий и предполагается, что их существует свыше миллиона, однако само применение понятия вида к бактериям сопряжено с рядом трудностей.

Спириллы отличаются спиральным (штопор) строением клетки и биполярным расположением жгутиков; энергию они получают за счет дыхания. Выделяют несколько родов спирилл. S. volutans - гигантская спирилла, которую всегда можно найти в свиной навозной жиже; она получила известность благодаря открытию «волютина» (полифосфатов); в чистой культуре растет только при пониженной концентрации 02 (примерно 5%), ее следует поэтому считать микроаэротолерантнои. Spirillum minus –возбудитель Содоку – болезни укуса крыс.

Метод Нейссера используется для выявления зерен волютина. Мазок окрашивается уксуснокислым метиленовым синим 2-3 минуты, при этом происходит химическое взаимодействие красителя и волютина. Зерна волютина окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем в течение 1 мин докрашивается везувином в желто-коричневый цвет.

Метод Циля-Нильсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.

1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин.

2. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.

3. Промывают водой.

4. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. После протравы соляной кислотой при нагревании в течение 2-3 мин мазок фиксируется и окрашивается по методу Циля-Нильсена. При этом цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный.

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.

7