Глава 5 генетика микроорганизмов

Генетика микроорганизмов как учение о наследственности и изменчивости имеет характерные

особенности, соответствующие их строению и биологии. Наиболее изучена генетика бактерий,

характерными чертами которых являются малые размеры и большая скорость размножения

бактериальной клетки, что позволяет проследить генетические изменения в течение

небольшого промежутка времени на большом числе популяций. Бактериальная клетка имеет

одинарный набор генов (нет аллелей). Хромосома бактерий является полинуклеотидом (две

полинуклеотидные цепочки ДНК) длиной 1000 мкм и мол. массой около 1,5.2-10'Д. Она

суперспирализована и замкнута в кольцо: содержит от 3000 до 5000 генов. Аналогично

хромосоме в цитоплазме бактерий располагаются ковалентне замкнутые кольца ДНК,

называемые плазмидами (внехромосомные факторы наследственности). Масса плазмид

значительно меньше массы хромосом. Хромосома и плазмида способны к автономному

самокопированию . репликации, поэтому их называют репликонами. Свойства микроорганизмов,

как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов

данной особи. Термин ²геном⌡ в отношении микроорганизмов . почти синоним

понятия ²генотип⌡.

Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой,

т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и

зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень

возможных для данной клетки фе-нотипических изменений определяются набором генов, каждый

из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды,

либо изменение самого

генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую

изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и

внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего

модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, . мутационная

изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК,

полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов,

проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.

Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной

изменчивостью.

5.1. Рекомбинации у бактерий

Рекомбинация (ре + лат. combinatio . соединение) . возникновение новых

последовательностей ДНК в результате разрывов и последующих восстановлений ее молекул. В

итоге таких изменений ДНК бактерий появляются так называемые рекомбинан-тные штаммы, или

рекомбинанты. Процесс рекомбинации у бактерий имеет некоторые отличия, связанные с

особенностями их генетического аппарата, форм генетического обмена. Именно на микробных

объектах были открыты формы переноса генетического материала - - трансформация,

трансдукция, конъюгация, неизвестные классической генетике, с помощью которых изучаются

молекулярные механизмы генетических рекомбинаций.*

В процессе генетического переноса участвуют бактерия-реципиент и бактерия-донор. Степень

участия их неравномерна: в ре-ципиентную клетку попадает лишь фрагмент экзогенной ДНК

бактерии-донора, который взаимодействует с цельной хромосомой реципиента, в результате

чего происходит частичное перераспределение (рекомбинация) генетического материала с

образованием рекомбинанта. Все этапы рекомбинации у бактерий обеспечиваются

соответствующими ферментами: рестриктазами, лигазами и др. У бактерий различают три типа

рекомбинаций: общую, ²незаконную⌡ и сайт-специфическую. Общая, или гомологичная,

классическая, рекомбинация происходит, если в структуре взаимодействующей ДНК имеются

гомологичные участки (от греч. homologia . соответствие). Так называемая ²незаконная⌡

рекомбинация для своего осуществления не требует значительной гомологии ДНК

взаимодействующих структур.

для интеграции с негомологичными участками репликонов. Транспозоны - - более сложные

генетические структуры ДНК, І которые содержат в своем составе IS-элементы и

дополнительные гены (например, гены лекарственной устойчивости и др). Подвижные

генетические элементы вызывают повреждение или инактивацию генов, слияние репликонов,

распространение re- j нов среди бактерий.

Общая рекомбинация наиболее эффективна при внутривидо- ] вом генетическом

обмене, ²незаконная⌡ рекомбинация играет важную роль не только в пределах отдельных

видов, но и между бактериями различных видов и родов.

Третьей разновидностью рекомбинации является так называемая сайт-специфическая

рекомбинация (от англ, seit . местоположение, участок), для осуществления которой

необходи- | мы строго определенные последовательности ДНК и специаль- '< ные ферменты.

Сайт-специфическая рекомбинация происходит в I менее протяженных участках генома (в

пределах 10.20 пар нук-леотидов), например при включении профага в строго ограниченные

участки (сайты) хромосомы.

Наиболее изучены три типа передачи ДНК, отличающиеся I друг от друга способом ее

транспортировки: трансформация, 1 трансдукция, конъюгация (рис. 5.1).

5.1.1. Трансформация

Трансформация (от лат. transformatio . превращение) заключается в том, что ДНК,

выделенная из бактерий в свободной растворимой форме, передается бактерии-реципиенту.

При трансформации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий род- I ственны друг другу.

В этом случае возможен обмен гомологичных участков собственной и проникшей извне ДНК.

Впервые І явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил ] мышам живой

невирулентный бескапсульный R-штамм пневмо- і кокка и одновременно убитый вирулентный

капсульный S-штамм І пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулентный

пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пневмококка. Таким образом, убитый S-штамм

пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пневмококка.

О. Звери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) доказали, что трансформирующим агентом в

этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки:

капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.

Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального

субстрата наследственности. При

изучении генетической трансформации у бактерий были разработаны методы экстракции и

очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.

5.1.2. Трансдукция

Трансдукция (от лат. transductio . перенос, перемещение) . передача ДНК от бактерии-

донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую)

трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую .

перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента.

Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага

дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая

трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора.

Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные

участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привносятся новые гены и ДНК фага в

виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается

лизоге-нией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с

хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе

соответствующего продукта, такая трансдукция называется абортивной,

5.1.3. Конъюгация

Конъюгация (от лат. conjugatio . соединение) описана Дж. Ле-дербергом и Э. Татумом

(1946), работавшими с мутантами кишечной палочки. Конъюгация бактерий состоит в переходе

генетического материала (ДНК) из клетки-донора (²мужской⌡) в клетку-реципиент

(²женскую⌡) при контакте 'клеток между собой.

Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор (от англ, fertility .

плодовитость), который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей.

Клетки, не содержащие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора .ни

превращаются в ²мужские⌡ и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме

в виде кольцевой двунитча-той молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фак-

тора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контролирующие процесс конъюгации, в

том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют ²мужскую⌡ и ²женскую⌡ клетки,

обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мое-

тик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F+; они передают

F-фактор клеткам, обозначаемым F" (²женским⌡), не утрачивая донорской способности, так і

как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии

приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками

(от англ, high frequency of recombination . высокая частота рекомбинаций), т.е.

бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F~

хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клет- j

ку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы і может длиться до 100 мин.

Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента -происходит гомологичная рекомбинация.

Прерывая процесс конъюгации бактерий, можно определять последовательность распо- і

ложения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выходе из хромосомы захватывать

небольшую ее часть, образуя так 1 называемый замещенный фактор -- F'.

При конъюгации происходит только частичный перенос генетического материала, поэтому ее

не следует отождествлять полностью с половым процессом у других организмов.

Важными факторами генетической изменчивости являются 1 плазмиды.

5.2. Плазмиды

Плазмиды . внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие

собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1.5 % ДНК хромосомы.

Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме

клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться

(интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и

нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из

одной бактерии в другую.

Термин ²плазмиды⌡ впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для

обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-

хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях

окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными

бактериями.

У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несущие гены, ответственные за

множественную устойчивость к ле-

карственным препаратам . антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды, или половой

фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей,

Ent-плазмиды, детерминирующие продукцию энтеротоксина.

Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, напри-мер возбудителей чумы,

столбняка, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода,

контролировать синтез белковых антибиотикоподобных веществ . бакте-риоцинов,

детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т.д. Существование множества других

плазмид у микроорганизмов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко

распространены у самых разнообразных микроорганизмов.

Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из

бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной

моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко

используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов (см. главу

6). Благодаря быстрому самокопированию и возможности конъюгаци-онной передачи плазмид

внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции

бактерий.

5.3. Мутации

Мутации (от лат. mutatio . изменение) . наследуемые изменения в генотипе, не связанные с

явлениями рекомбинаций. Мутации определяются изменениями последовательности нуклеоти-дов

в ДНК. Изменения последовательности нуклеотидов в ДНК могут быть следствием разных

процессов: ошибка при репликации, выпадение участков (делеция), перемещение отдельного

участка относительно другого (транслокация) и др.

Мутации у бактерий обнаруживаются по изменению любого известного признака микроорганизма

(например, способность синтезировать аминокислоту, чувствительность к антимикробным

препаратам и др.). Существуют различные типы мутаций. По происхождению мутации могут

быть спонтанными или индуцированными. Первые возникают без вмешательства

экспериментатора, вторые . в результате воздействия мутагенов на бактериальную

популяцию, т. е. физических, химических или биологических факторов, способных вызывать

мутацию. К мутагенам относятся различные виды радиации, температура, ряд химических

соединений (нитраты, нитриты, бромурацил, 2-аминопурин, нитрозогуанидин и др.). Частота

спонтанных мутаций в среднем

Равна Ю-'.

Мутации подразделяют на прямые и обратные, если речь идет

о направлении мутационного изменения. Мутации, возникающие в геноме ²дикого типа⌡ у

бактерий в естественных условиях обитания, называются прямыми. Образовавшиеся особи

являются мутантами. Мутации, завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому,

называются обратными, или реверсией. Особи, возникшие в результате обратных мутаций,

называются ревертантами. В настоящее время отдельные реверсии и лежащие в их основе

механизмы изучены лишь у бактерий и вирусов. Предполагается достаточно универсальный

характер этих процессов. Реверсии возникают под действием тех же факторов окружающей

среды, которые вызывают появление прямых мутаций. Реверсия может быть ²истинной⌡ в

результате восстановления первоначального состояния мутантного гена; если она происходит

за счет дополнительной мутации, то называется супрес-сорной мутацией.

Большинство происходящих в ДНК изменений приводит к вредным мутациям либо вызывает

гибель микроорганизмов. Поэтому все клетки имеют особые механизмы реконструкции,

исправления повреждений, называемые репарационными.

Одной из форм мутаций является диссоциация (от лат. dissociatio . расщепление) .

возникновение в популяции микроорганизмов особей, отличающихся от исходных

микроорганизмов внешним видом и структурой колоний, так называемых S-и R-форм (от англ,

smooth . гладкий, rough . шероховатый). S-формы колоний . круглые, влажные, с блестящей

гладкой поверхностью, ровными краями; R-формы образуют колонии неправильной формы,

непрозрачные, сухие с зазубренными краями и неровной шероховатой поверхностью.

Различному внешнему виду колоний соответствует ряд свойств. Чаще S-формы более

вирулентны, клетки имеют нормальную морфологию, биохимически "более активны, обычно

выделяются в остром периоде заболевания; у капсульных видов хорошо развиты капсулы, у

подвижных видов имеются жгутики. Гладкие (S) и шероховатые (R) колонии являются крайними

формами диссоциации, между которыми могут встречаться переходные формы. Диссоциация

рассматривается как явление генетической природы, связанное с хромосомными мутациями

генов, контролирующих синтез липополисахаридов клеточной стенки бактерий.

Диссоциация известна у многих видов. Обычно она выявляется в стареющих культурах.

Диссоциация возникает и в природных условиях (у патогенных микроорганизмов в живом

организме). Большинство микроорганизмов имеет полноценные свойства, находясь в S-форме,

однако существуют исключения: для ми-кобактерий туберкулеза, бацилл сибирской язвы и

возбудителя чумы нормальной является R-форма колоний.

5.4. Особенности генетики вирусов

Геном вирусов имеет простое строение и малую молекулярную массу. Число генов у вирусов

колеблется от 4.6 (парвовирусы) до 150 генов и больше (вирус оспы). В основе

изменчивости вирусов лежат мутации. Мутации носят случайный характер или могут быть

направленными. Вирус, являясь облигатным внутриклеточным паразитом, реализует этот

паразитизм на генетическом уровне. Присутствие нескольких типов вирусов в инфицированных

клетках, т.е. смешанная инфекция, может приводить к таким генетическим взаимодействиям

между ними, как множественная реактивация, рекомбинация, кросс-реактивация и др.; могут

иметь место и негенетические взаимодействия . комплементация и др.

Множественная реактивация . процесс взаимодействия вирусов с поражением разных генов, в

результате которого взаимодействующие вирионы дополняют друг друга благодаря

генетической рекомбинации, образуя неповрежденный вирус. Рекомбинация . обмен

генетическим материалом между вирусами . возможна в виде обмена генами (межгенная

рекомбинация) или участками одного и того же гена (внутриген-ная рекомбинация). У

вирусов рекомбинация происходит в процессе заражения двумя или более типами вирусов,

отличающимися друг от друга по генетическим признакам. Вариантом рекомбинации является

перекрестная реактивация, или кроес-реактивация, происходящая в том случае, когда у

одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном нормальный. При

смешанной инфекции двумя такими вирусами в результате рекомбинации появляются штаммы

вируса со свойствами родительских микроорганизмов.

В качестве примера негенетического взаимодействия вирусов может быть приведена

комплементация: при смешанной инфекции стимулируется репродукция обоих участников

взаимодействия или одного из них без изменения генотипов вирусов. Комплементация широко

распространена среди вирусов и наблюдается между как родственными, так и неродственными

вирусами. Обмен генетическим материалом при этом феномене не наблюдается.

Если геном одного вируса заключен в капсид другого вируса, этот феномен называется

фенотипическим смешиванием, наблюдаемым при смешанной инфекции.

Возможны также генетические взаимодействия неродственных вирусов, изучаемые генетической

инженерией (см. главу 6).

Изучение генетики микроорганизмов не только имеет важное биологическое значение, но и

способствует решению многих медицинских пооблем, таких, как разработка патогенетических

ос-

нов лечения и профилактики инфекционных болезней, спосо-1 бов диагностики (гтолимеразная

цепная реакция, ДНК-зонды), создание профилактических, лечебных и диагностических

препаратов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации, т.е. увеличении

количества копий специфического (²маркерного⌡) гена возбудителя. Для этого двунитчатую

ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют (²расплетают⌡) и достраивают

к ²расплетенным⌡ нитям ДНК і новые комплементарные нити, в результате чего из одного

гена ] образуются два. Этот процесс копирования генов многократно і повторяется при

различных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит

в пробирке (in vitro) при добавлении к амплифицируемым генам прай-меров (затравки из

коротких однонитевых ДНК), ДНК-полиме- : разы и нуклеотидов.