Проведение расщепления днк рестриктазами
Реакционная смесь обычно содержит 0,2-1 мкг ДНК в объеме 20 мкл или менее.
1. Добавьте воду к раствору ДНК в стерильной пробирке фирмы Эппендорф до объема 18 мкл и перемешайте.
2. Добавьте 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной концентрации и перемешайте, слегка постукивая по пробирке пальцем.
3. Добавьте 1 ед. рестриктазы и перемешайте, слегка постукивая по пробирке пальцем. (1 ед. Фермента – это количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК за 1 ч в определенном буфере и при определенной температуре в объеме 20 мкл. Как правило, расщепление рестриктазами, проводимое в течение более длительных периодов времени или при избытке фермента, не приводит к осложнениям, если в препарате фермента отсутствуют примеси ДНКазы или экзонуклеазы. В имеющихся в продаже препаратах рестриктаз такие примеси обнаруживаются редко.)
4. Инкубируйте смесь при подходящей температуре в течение необходимого времени.
5. Остановите реакцию добавлением 0,5 М ЭДТА, рН 7,5, до конечной концентрации 10 мМ.
Если ДНК анализируют сразу в геле, добавьте 6 мкл красителя в буфере для нанесения I, перемешайте смесь встряхиванием и нанесите расщепленную ДНК на гель.
Если обработанная рестриктазой ДНК нуждается в очистке, экстрагируйте ее один раз смесью фенол-хлороформ, один раз хлороформом и осадите этанолом.
Примечания
Рестриктазы – дорогие ферменты! Связанные с ними затраты могут быть
сведены к минимуму, если следовать приведенным ниже правилам.
А. Чтобы отобрать небольшое количество фермента из упаковки с концентрированным раствором рестриктазы, быстро коснитесь кончиком стеклянной микропипетки разового пользования (на 5 мкл) поверхности раствора фермента. Таким способом можно отобрать всего 0,1 мкл раствора фермента.
Б. Рестриктазы стабильны при хранении при –20оС в буфере, содержащем 50% глицерин. При проведении расщепления ДНК растриктазами приготовьте реакционную смесь, содержащую все компоненты, кроме фермента. Достаньте из морозильника фермент и сразу же поместите его в лед. Работайте как можно быстрее, чтобы фермент находился вне морозильника минимальное время. Сразу же после использования поместите фермент обратно в морозильник.
В. Используйте минимальные объемы реакционной смеси, уменьшая в ней
количество воды, насколько это возможно. Проверьте, однако, чтобы объем внесенной рестриктазы составлял менее 1/10 конечного объема реакционной смеси, иначе активность фермента может ингибироваться глицерином.
Г. Когда ДНК необходимо обработать двумя или более рестриктазами, реакцию можно проводить одновременно при условии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфере. В противном случае первым следует использовать фермент, функционирующий в буфере с более низкой ионной силой. После этого в реакционную смесь можно добавить необходимое количество соли и второй фермент (ферменты) и продолжить инкубацию.
Краткое описание некоторых ферментов рестрикции, поставляемых фирмой « Сибэнзим », город Новосибирск.
|
Название |
Aat II |
|
Сайт узнавания |
GACGT↑C C↓TGCAG | |||||||||||||||
|
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген Aat II из Acetobacter aceti | |||||||||||||||
|
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда | |||||||||||||||
|
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. | |||||||||||||||
|
Оптимальный SE-буфер |
Y (33 mM Tris-ацетат (pH 7.9 при 25°C); 10 mM магний-ацетат; 66 mM калий-ацетат; 1 mM DTT.) | |||||||||||||||
|
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
| |||||||||||||||
|
Оптимальная температура |
37oC | |||||||||||||||
|
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 1 mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке | |||||||||||||||
|
Лигирование |
После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. | |||||||||||||||
|
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. | |||||||||||||||
|
Чувствительность к метилированию |
не проверялось | |||||||||||||||
|
Инактивация 20 мин при |
65oC | |||||||||||||||
|
Примечание |
Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер Y | |||||||||||||||
|
Литература: |
Sugisaki H., Maekawa Y., Kanazawa S., Takanami M. Nucleic Acid Res. 10:5747-5752(1982) | |||||||||||||||
|
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 13273, 10739, 9980, 1945 ДНК аденовируса-2 |
|
|
Название |
|
|
Сайт узнавания |
G↑ANTC CTNA↓G | ||||||||||
|
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген HinfI из Haemophilus influenzae | ||||||||||
|
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда | ||||||||||
|
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. | ||||||||||
|
Оптимальный SE-буфер |
O (50 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) | ||||||||||
|
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
| ||||||||||
|
Оптимальная температура |
37oC | ||||||||||
|
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке | ||||||||||
|
Лигирование |
После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. | ||||||||||
|
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. | ||||||||||
|
Чувствительность к метилированию |
не проверялось | ||||||||||
|
Инактивация 20 мин при |
80oC | ||||||||||
|
Примечание |
С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер O. |
|
Название |
|
|
Сайт узнавания |
A↑AGCTT TTCGA↓A |
| |||||||||||||||
|
Источник |
Из штамма E.coli несущего клонированный ген HindIII из Haemophilus influenzae Rd | ||||||||||||||||
|
Субстрат для определения активности |
ДНК фага лямбда | ||||||||||||||||
|
Единица активности |
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. | ||||||||||||||||
|
Оптимальный SE-буфер |
W (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) + BSA | ||||||||||||||||
|
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: |
| ||||||||||||||||
|
Оптимальная температура |
37oC | ||||||||||||||||
|
Условия хранения |
10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке | ||||||||||||||||
|
Лигирование |
После гидролиза 50-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. | ||||||||||||||||
|
Неспецифический гидролиз |
Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. | ||||||||||||||||
|
Чувствительность к метилированию |
не проверялось | ||||||||||||||||
|
Инактивация 20 мин при |
80oC | ||||||||||||||||
|
Примечание |
Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер W, BSA. | ||||||||||||||||
|
Литература: |
Old,
R., Murray, K., Roizes, G. J. Mol. Biol. 92: 331-339 (1975).
| ||||||||||||||||
|
Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке 15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 Маркер
|
|
|
В.А.
Чернухин,
М.А.
Абдурашитов,
В.Н.
Томилов,
Д.А.
Гончар,
С.Х.
Дегтярев
Сравнительный
рестрикционный
анализ
хромосомной
ДНК
крысы
in vitro и
in silico
// Вестник
биотехнологии
и
физико-химической
биологии
имени
Ю.
А.
Овчинникова,
2006, т.
2, №3, с.
39-46 
