Методи дослідження протеому

Кінцевою точкою експресії спадкової інформації є набір білків. Аналіз складу цього набору (протеому), відносної кількості окремих білків і складної картини взаємодій між ними є одним із найактуальніших завдань.

Історично першим підходом (який зберігає своє значення) для аналізу складної білкової суміші став двовимірний електрофорез у поліакриламідному гелі. У цьому методі білкова суміш послідовно розганяється у двох взаємно перпендикулярних напрямках у різних електрофоретичних буферах (з різним рН, іонним складом тощо). Часто в першому напрямку відбувається розділення білків за їхнім зарядом, у другому – за молекулярною масою (у присутності додецилсульфату натрію), що дозволяє ефективно розділити до 1 тис. білків одночасно.

Зручним і потужним методом розділення білкових сумішей є високоефективна рідинна хроматографія (High Performance Liquid Chromatography – HPLC). Найчастіше розчин денатурованих білків наноситься на колонку, заповнену твердими пористими частинками, які адсорбують білки за рахунок гідрофобних взаємодій. Змивання (елюція) розчинником, який пропускається через колонку під високим тиском і полярність якого варіюється (наприклад, лінійно зростає), дозволяє розділити окремі білки, що незначною мірою розрізняються один від одного за своєю гідрофобністю. Метод використовують як для аналізу, так і з метою виділення та очистки білків.

Найпотужнішим засобом аналізу складних білкових сумішей є мас-спектрометрія, принцип якої полягає в розділенні пучка заряджених частинок в електричному та магнітному полі на окремі фракції з однаковим відношенням маси до заряду. Сучасні методи іонізації зразків дозволяють іонізувати й переводити в газову фазу великі органічні сполуки, у тому числі олігопетиди та білки. Наявність 10 – 15 моль/л білка з молекулярною вагою до 200 тис. може бути детектована за допомогою сучасних мас-спектрометрів.

Проте визначення маси білка ще не дозволяє точно ідентифікувати його. З цією метою білок (після його виділення за допомогою двовимірного електрофорезу або рідинної хроматографії) піддають обмеженій протеолітичній деградації. Отримана комбінація олігопептидів, маса яких визначається за допомогою масспектрометрії, є своєрідним відбитком даного білка. Наступний аналіз геномних послідовностей дозволяє знайти відповідну амінокислотну послідовність білка, що практично позбавляє від необхідності хімічного визначення такої послідовності. З іншого боку, так звана тандемна мас-спектрометрія дозволяє отримати пряму інформацію щодо послідовності олігопептидів завдяки їхній вторинній фрагментації в камері спектрометра та наступного визначення розподілу отриманих фрагментів за масою.

Поєднання масспектрометра з рідинним хроматагрофом – протеоліз білкової суміші, розділення олігопептидів методами рідинної хроматографії, аналіз їх за допомогою масспектрометрії та наступний пошуку базах даних з метою їхньої ідентифікації – це найперспективніший шлях розвитку кількісної протеоміки.

Наступним кроком у вивченні протеому є з’ясування складної картини білок-білкових взаємодій. Одним із найефективніших методів дослідження таких взаємодій є так званий pull-down: молекула певного білка, що використовується як пастка (bait), адсорбується на колонці (завдяки пришитому до білка специфічному «ярлику» – tag), через колонку пропускається білкова суміш, утворені білкові комплекси аналізуються за допомогою гель-електрофорезу. Ідентифікацію білків, вилучених із комплексів і розділених шляхом електрофорезу, можна також здійснити за допомогою мас-спектрометрії. Цілком аналогічно до ДНК-мікроареїв, у дослідженнях білок-білкових взаємодій використовують також білкові мікроареї – скельця з пришитими до них білками (понад 5 тис. білків), які дозволяють здійснювати скринінг протеому.

Фізичні методи дослідження структури й активності біомакромолекул

Широкого застосування в молекулярній біології набули різноманітні фізичні методи, важливість яких важко переоцінити. Нижче наведено перелік основних таких методів із зазначенням деяких особливостей і характеру інформації, яку можна отримати за їхньою допомогою.

Методи безпосереднього спостереження

Історично першим методом спостереження досить великих макромолекулярних комплексів із роздільною здатністю у манометровому діапазоні стала електронна мікроскопія. При застосуванні цього методу зразок розміщують у вакуумній камері мікроскопа, опромінюють променем електронів, який далі проектується на флуоресцентний екран. Зразок при цьому має бути «зафарбований» певною речовиною, непрозорою для електронів.

Одна з поширених технік полягає в тому, що макромолекули наносять на карбонову підкладку, практично прозору для електронного променя (як і макромолекули), і фіксують на ній. Потім підкладку промивають розчином солі важкого металу, наприклад уранілацетатом. Після висушування така підкладка стає непрозорою для електронів скрізь, крім ділянки, де розміщена макромолекула, й уранілацетат не зв’язався з підкладкою. Така техніка негативного контрасту дозволяє спостерігати під електронним мікроскопом молекули ДНК, комплекси ДНК із білками (такі як нуклеосоми), мультибілкові комплекси тощо. Розділення при негативному контрасті лімітоване розміром частинок важкого металу.

Важливим варіантом електронної мікроскопії, який дозволяє уникнути фіксації та контрастування зразка, є кріоелектронна мікроскопія. Тонкий шар (~100 нм) розчину макромолекул на підкладці швидко заморожується до –160 °C і при цій температурі розміщується в охолодженій вакуумній камері мікроскопа. Виявляється, що такі зразки дають достатньо високий рівень контрасту без додаткової обробки. Кріоелектронна мікроскопія відіграла важливу роль у дослідженнях структури та механізмів функціонування рибосоми.

Сучасною альтернативою електронної мікроскопії є мікроскопія атомних сил (AFM – Atomic Force Microscopy). Макромолекули адсорбуються на підкладці, після чого зразок може бути дослідженим як після висушування, так і в разі, коли залишається шар рідини.

Підкладка сканується голкою з надзвичайно тонким вістрям, яке за рахунок міжатомних (вандерваальсових) сил взаємодіє з поверхнею, відстежуючи її «ландшафт» (рис. 18). Рух голки реєструється оптичною системою (лазерний промінь, що віддзеркалюється від голки на фотодіод), і перетворюється комп’ютером у зображення поверхні. Роздільна здатність є порівнянною з такою електронного мікроскопа, однак, на відміну від електронної мікроскопії, AFM не потребує фіксації та контрастування зразка, дозволяє працювати з макромолекулами, що перебувають в умовах, близьких до фізіологічних. Крім того, існує можливість кількісної оцінки висоти зміщення голки відносно поверхні підкладки.

Рис. 18. Принцип мікроскопії атомних сил (AFM).