Методи дослідження одиничних макромолекул

Більшість методів дослідження (за винятком мікроскопії різних типів) передбачає роботу з досить великою кількістю – ансамблем – однакових молекул. Останнім часом розвиваються методи, що дозволяють слідкувати за поведінкою одиничних (звичайно, досить великих) макромолекул і макромолекулярних комплексів: ДНК та її комплексів з білками, хроматинової фібрили, актоміозинової фібрили тощо.

Одним із прикладів таких підходів є застосування магнітного пінцета (magnetic tweezers). У випадку ДНК (рис. 19), молекули (довжиною ~5 тис. пар основ чи більше) пришивають за один кінець до покривного скельця мікроскопа, за інший – до парамагнітної кульки ~2 мкм у діаметрі. Розмір кульки дозволяє слідкувати за нею (тобто за індивідуальною молекулою ДНК) за допомогою звичайного оптичного мікроскопа. Кулька знаходиться в полі електромагніта, який можна переміщувати або обертати, як показано на рис. 19, прикладаючи тим самим зовнішню силу до кінця молекули. Відповідь на зміну зовнішньої сили, що проявляється у відстані кульки від скельця (дефектується відеокамерою), несе інформацію про еластичні властивості молекули, тобто про сили, що цю молекулу стабілізують.

Рис. 19. Принципова схема експерименту з ДНК за допомогою магнітного пінцета.

За допомогою підходів такого типу отримано цінну інформацію, зокрема про жорсткість ДНК щодо розтягування та кручення, структурні особливості деяких білково-нуклеїнових комплексів, конформаційні перебудови нуклеосом, тонкі механізми роботи РНК-полімерази в реальному часі.

Контрольні запитання

1. У чому полягає процес клонування ДНК? Яким вимогам має відповідати плазмідний вектор для клонування і чому?

2. Що таке рестриктази та як їх використовують у рекомбінантних технологіях?

3. Поясніть принцип і охарактеризуйте основні типи гель-електрофорезу.

4. Що таке геномна бібліотека? Як створюються такі бібліотеки?

5. Дайте визначення кДНК. Як створюють бібліотеку клонів кДНК?

6. Що таке гібридизація? Як здійснюється гібридизація ДНК на нітроцелюлозних фільтрах?

7. Опишіть основні принципи полімеразної ланцюгової реакції.

8. Як здійснюють секвенування ДНК за Сангером?

9. Опишіть принципову схему експресії рекомбінантних білків у бактеріальних клітинах.

10. Що таке блотгібридизація? Яка різниця між Саузерн-, нозерн- і вестерн-блотингом?

11. Як здійснюють фінгерпринтинг ДНК?

12. Яким чином можна визначити стартові та кінцеві точки транскрипції?

13. Як аналізують активність геному за допомогою ДНК-мікроареїв?

14. Що таке футпринтинг ДНК?

15. Як і з якою метою здійснюють імунопреципітацію хроматину?

16. Охарактеризуйте основні фізичні методи дослідження біологічних макромолекул.

17. Дайте визначення гіперхромного ефекту. Як його використовують?

18. Яким чином можна з’ясувати просторову структуру макромолекули з високою роздільною здатністю?

Рекомендована література

1. Глик, Б., Пастернак, Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М. : Мир, 2002.

2. Кантор, Ч., Шиммел, П. Биофизическая химия : в 3 т.– М. : Мир, 1984.

3. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. – М. : МЦНМО, 2002.

4. Branden, C.I., Tooze, J. Introduction to protein structure. – New York : Garland Science, 1999.

5. Cheung, V.G., Morley, M., Aguilar, F. et al. Making and reading microarrays // Nature Genetics Supplement. – 1999. – Vol. 21. – P. 15 – 19.

6. Chiu, W. Electron microscopy of frozen, hydrated biological specimens // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. – 1986. – Vol. 15. – Р. 237 – 257.

7. Cooke, R.M., Cambell, I.D. Protein structure determination by nuclear magnetic resonance // Bioessays. – 1988. – Vol. 8. – Р. 52 – 56.

8. Gerstein, M., Lan, N., Jansen, R. Proteomics: integrating interactomes // Science. – 2002. – Vol. 295. – Р. 284 – 287.

9. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. – 2001. – Vol. 409. – Р. 860 – 921.

10. Leibowitz, M. J., Barone, F. P., Georgopoulos, D. E. In vitro protein synthesis // Meth. Enzymol. – 1991. – Vol. 194. – Р. 536 – 545.

11. Lesk, A.M. Introduction to bioinformatics. – New York : Oxford University Press, 2002.

12. Lionnet, T., Dawid, A., Bigot, S. et al. DNA mechanics as a tool to probe helicase and translocase activity // Nucl. Acids Res. – 2006. – Vol. 34. – Р. 4232 – 4244.

13. Nature Nanotechnology, 2009; doi:10.1038/nnano.– 2009. – Р. 379

14. PCR technology: principle and applications for DNA amplification ; ed. H.Erlich. – New York : .H.Freeman and Company, 1992.

15. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. – Cold Spring Harbor, New York : CSHL Press, 2001.

16. Service, R.F. Microchip arrays put DNA on the spot // Science. – 1998. – Vol. 282. – Р. 396 – 399.

17. Wolfsberg, T.G., Wetterstrand, K.A., Guyer, M.S. et al. A user’s guide to the human genome // Nature Genenics Supplement. – 2002. – Vol. 32. – Р. 4 – 79.