Гель-електрофорез

Після виділення клонованого рекомбінантного вектора та розрізання його рестриктазою постає проблема відокремити фрагмент ДНК від вектора. З цією метою найчастіше застосовують гель-електрофорез – надзвичайно важливий метод у молекулярній біології.

Принцип електрофорезу дуже простий (рис. 4). Суміш фрагментів ДНК (або РНК) наносять у лунку пластинки гелю – середовища, сформованого полімерною сіткою. Зазвичай гель виготовляють на основі агарози або поліакриламіду. Через нього пропускають електричний струм, завдяки чому негативно заряджені молекули нуклеїнової кислоти рухаються в електричному полі. Полімерна сітка гелю створює для цього руху суттєвий опір, якій долається тим легше, чим меншим є розмір фрагмента. Через певний час фрагменти розділяються на окремі зони – смуги гелю, які містять гомогенний набір фрагментів одного розміру. Для візуалізації смуг гель забарвлюють флуоресцентним барвником (найчастіше використовують бромистий етидій), який зв’язується з ДНК. Після цього смугу можна вирізати з гелю, та екстрагувати ДНК.

Гель-електрофорез широко використовують також і як аналітичний засіб із метою з’ясування складу суміші. Для візуалізації смуг (особливо якщо розділюють невеликі кількості ДНК) часто застосовують радіоактивне мічення ДНК шляхом уведення радіоактивного ізотопу ³²Р у склад 5′-кінцевих фосфатних залишків. Після електрофорезу здійснюється авторадіографія: на гель накладають фотопластинку, яка засвічується напроти смуг унаслідок їхньої радіоактивності. Альтернативою авторадіографії є експонування гелю на спеціальний фосфорний екран, який потім сканується сполученим із комп’ютером приладом – фосфоріміджером. Окрім вищої, якщо порівнювати з авторадіографією, чутливості, використання фосфоріміджера має ту перевагу, що дозволяє зі значно вищою точністю оцінювати кількість матеріалу в смузі.

Рис. 4. Розділення фрагментів ДНК за розміром шляхом гель-електрофорезу.

Праворуч – окремі зони, що містять розділені фрагменти.

У найпростішому варіанті – для розділення фрагментів дволанцюгової ДНК за розміром – найчастіше використовують агарозні гелі. Поліакриламідний гель (ПААГ) має значно різноманітніше застосування. Зокрема, саме ПААГ використовують для розділення сумішей білків. Найпопулярнішим є варіант електрофорезу білків у присутності додецилсульфату натрію – зарядженого детергента, який розгортає поліпептидний ланцюгі вкриває його своєрідною «шубою». У результаті відбувається розділення ланцюгів різної довжини за принципом, що ілюструє рис. 4.

На рухливість макромолекул під час електрофорезу впливає також їхня форма. Відповідно, за допомогою електрофорезу можна,зокрема, розділити:

• Молекули ДНК, що містять перманентні вигини, зумовлені особливою послідовністю пар основ – вигнута ДНК більшою мірою гальмується полімерною сіткою гелю.

• Циркулярні та лінійні молекули ДНК, а також окремі циркулярні топоізомери, оскільки вони розрізняються за ступенем компактності.

• Молекулу вільної ДНК і комплекс цієї ДНК із білком – зрозуміло, що комплекс більше гальмується сіткою гелю.

Особливим варіантом електрофорезу нуклеїнових кислот є електрофорез одноланцюгових фрагментів ДНК у денатуруючих умовах (підвищена температура, висока концентрація сечовини). Якщо такий гель (поліакриламідний) досить тонкий (~0,4 мм – секвенуючий гель), він дозволяє розділити фрагменти, довжина яких різниться на один нуклеотид.