6. Принцип действия флуоресцентных оптических микроскопов, их достоинства и недостатки.
Флуоресцентный микроскоп —специализированный оптический микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флуоресценции. Молекулы способны поглощать кванты света и переходить в электронно-возбужденные состояния. Возвращение молекулы в «обычное» (основное) состояние, сопровождающееся излучением света, называют флуоресценцией. Основной принцип работы флуоресцентного микроскопа заключается в облучении образца заданной определенной полосой длин волн вызывающих флуоресценцию образца. Затем необходимо выделить намного более слабое излучение флуоресценции. В идеально настроенном микроскопе, только свет от флуоресценции должен достичь глаза исследователя или детектора так, чтобы в результате флуоресцентные структуры выделялись с высокой контрастностью на очень темном (или черном) фоне. Проблема состоит в том, что свет возбуждения, как правило, в несколько сотен тысяч, а иногда и в миллион раз ярче, чем свет излучаемой флуоресценции. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа состоит из источника ультрафиолетового излучения, возбуждающего и запирающего светофильтров, теплового (теплозащитного) фильтра и специального люминесцентного объектива. Источник света излучает волны в УФ области спектра, которые проходят через фильтр, где отсекаются волны другого спектрального ряда. УФ лучи попадают на изучаемый препарат и вызывают его люминесценцию. Свет люминесценции проходит через запирающий фильтр, который не пропускает свет возбуждения (ультрафиолетовые волны) и далее формирует изображение в объективе. Для проведения флуоресцентной микроскопии используют метод освещения препарата в проходящем свете и метод освещения в падающем свете. Лучшее разрешение традиционных микроскопов составляет более 200 нм, но позволяет сканировать на некоторую глубину образца, а не только поверхность, как атомный силовой микроскоп.
7. Микроскопия темного поля
Для микроскопии в темном поле применяются особые конденсоры, у которых центральная часть линзы затемнена, за исключением узкой полоски по периферии. При работе по методу темного поля, препарат освещается полым световым конусом, апертура которого больше, чем апертура объектива, таким образом, входной зрачок микрообъектива оказывается в области геометрической тени и прошедший без преломления свет не попадает в объектив. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.
Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а «освещающий» световой пучок не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой.
Преимущество микроскопии в темном поле зрения состоит в том, что при этом можно видеть объекты более мелкие. Кроме того, в темном поле зрения лучше наблюдать в живом состоянии такие микробы, как лептоспиры, которые в водной среде не преломляют света и поэтому в проходящем свете совершенно прозрачны. Основным ограничивающим фактором метода является то, что только малая часть падающего света в итоге формирует изображение, поэтому необходимо применять достаточно мощные источники света, что иногда приводит к повреждениям образца (сейчас иногда используют лазеры). Значительное ограничение метод накладывает на разрешающую способность системы — апертура объективов, работающих по методу темного поля существенно ниже светлопольных, так как она не должна перекрывать затемненную часть апертуры конденсора. Применение: Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов — простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток. Темнопольная микроскопия в последнее время используется в производстве компьютерных мышей с тем чтобы обеспечить работу оптических мышей в том числе и на прозрачных стёклах, имеющих микроскопические дефекты или пыль на поверхности.
8) Ближнепольная оптическая микроскопия - оптическая микроскопия, обеспечивающая разрешение лучшее, чем у обычного оптического микроскопа. Повышение разрешения БОМа достигается детектированием рассеяния света от изучаемого объекта на расстояниях меньших, чем длина волны света. В случае, если зонд (детектор) микроскопа ближнего поля снабжен устройством пространственного сканирования, то такой прибор называют сканирующим оптическим микроскопом ближнего поля. Такой микроскоп позволяет получать растровые изображения поверхностей и объектов с разрешением ниже дифракционного предела. Зондом служит оптический волновод (световолокно), сужающийся на том конце, который обращен к образцу, до диаметра меньше длины волны света. Световая волна при этом не выходит из волновода на большое расстояние, а лишь слегка “вываливается” из его кончика. На другом конце волновода установлены лазер и приемник отраженного от свободного торца света. При малом расстоянии между исследуемой поверхностью и кончиком зонда амплитуда и фаза отраженной световой волны меняются, что и служит сигналом, используемым при построении трехмерного изображения поверхности.
Если заставить свет пройти через диафрагму диаметром 50-100 нм и приблизить ее на расстояние несколько десятков нанометров к поверхности исследуемого образца, то, перемещая такой «источник света» по поверхности от точки к точке (и обладая достаточно чувствительным детектором), можно исследовать оптические свойства данного образца в локальной области, соответствующей размеру отверстия.
Именно так устроен сканирующий ближнепольный оптический микроскоп (СБОМ). Роль отверстия (субволновой диафрагмы) обычно выполняет оптоволокно, один конец которого заострен и покрыт тонким слоем металла, везде, кроме небольшой области на самом кончике острия (диаметр «незапыленной» области как раз составляет 50-100 нм). С другого конца в такой световод поступает свет от лазера.
Схема устройства ближнепольного оптического микроскопа
С помощью СБОМ можно изучать оптические явления с пространственным разрешением 30-50 нм. Отличительной особенностью СБОМ является принципиальная необходимость работать с очень слабыми сигналами.